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山东畜牧兽医 2014年第7期35卷 66-68页

作者：郭全海赵耀光商丘职业技术学院动物工程系河南商丘476000

甲病毒载体是近年研究比较热的一种新型载体，对载体的构建、诱导机体的免疫作用机制、构建高效疫苗等方面研究较多，也取得了很大的成果。甲病毒载体的利用具有良好的前景，但其安全性和存在的问题还有待进一步研究。

关键词：甲病毒载体载体构建应用免疫作用机制安全性

流行性腹泻病毒M基因与甲病毒载体重组RNA的构建

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动物医学进展 2005年第5期26卷 73-76页

作者：余丽芸侯喜林黑龙江八一农垦大学生命科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因导入甲病毒载体(plasmid Semliki ForestViru,pSFV) ,研究该基因及其编码蛋白的表达。首先将扩增的病毒M 基因导入pSFV的SP6 启动子下游。用Spe Ⅰ酶将pSFV M重组质粒DNA 线性化,再将其体外转录成5′末... 详细信息

将猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因导入甲病毒载体(plasmid Semliki ForestViru,pSFV) ,研究该基因及其编码蛋白的表达。首先将扩增的病毒M 基因导入pSFV的SP6 启动子下游。用Spe Ⅰ酶将pSFV M重组质粒DNA 线性化,再将其体外转录成5′末端含帽子结构的重组RNA。然后通过电穿孔法将此重组RNA转染BHK 21 细胞,收集病毒样粒子用于感染BHK 21 细胞。采用细胞免疫化学的方法对转染和感染细胞的表达产物进行分析。pSFV M RNA 转染和病毒粒子感染哺乳动物细胞表达的M 蛋白,可与PEDV多克隆抗体起特异反应,证明体外转录的重组RNA 含有PEDV M的特异序列。

关键词：猪流行性腹泻病毒 M基因甲病毒载体重组RNA

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甲病毒表达载体系统的研究进展

国外医学（分子生物学分册） 2001年第1期23卷 49-51页

作者：陈水平军事医学科学院微生物流行病研究所微检中心北京100071

甲病毒载体是一种新型的载体系统。近年来 ,关于该载体系统的研究很多 ,尤其是在蛋白质的表达、结构与功能的研究以及疫苗的研制方面。本文仅就甲病毒载体的构建及其应用作一简单介绍。

关键词：甲病毒载体蛋白质表达疫苗载体构建

登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究

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微生物学报 2001年第3期41卷 334-339,T001页

作者：于曼秦鄂德赵卫胡志君苑锡同军事医学科学院微生物流行病研究所北京100850

将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后... 详细信息

将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后将转染的宿主细胞用登革 2型病毒株攻击 ,并分别观察含正、反义PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒效果。通过碱基序列测定 ,筛选出含PrM基因正、反向插入的pSFV PrM重组质粒。并获得了经重组RNA与辅助RNA共转染细胞而产生的重组病毒颗粒。含有反义PrM基因的重组病毒RNA ,在宿主细胞中具有抗登革 2型病毒复制的作用 ,而且强于含正义PrM基因的重组病毒RNA。

关键词：登革2型病毒 PrM基因甲病毒载体抗病毒作用

融合免疫佐剂Lipo多肽与包膜蛋白EDⅢ区的登革病毒四价疫苗的构建及免疫效应研究

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中国人兽共患病学报 2016年第2期32卷 119-123页

作者：任守凤曹国梅谭峰梁韶晖刘文权潘长旺温州医科大学基础医学院人体寄生虫学教研室温州325035

目的构建编码免疫佐剂Lipo多肽与登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII区的重组甲病毒载体,并在小鼠体内研究其免疫效应,为研制新型的登革病毒四价疫苗奠定基础。方法先通过GS linker将编码免疫佐剂Lipo多肽的基因序列与编码登革病毒1-4型包膜蛋... 详细信息

目的构建编码免疫佐剂Lipo多肽与登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII区的重组甲病毒载体,并在小鼠体内研究其免疫效应,为研制新型的登革病毒四价疫苗奠定基础。方法先通过GS linker将编码免疫佐剂Lipo多肽的基因序列与编码登革病毒1-4型包膜蛋白EDIII区的基因序列进行串联获得LipoEDIII;然后将LipoEDIII基因插入甲病毒载体DREP的多克隆位点,构建重组甲病毒载体DREP-LipoEDIII;将DREP-LipoEDIII转染293细胞,Western blot检测融合蛋白的表达;随后将DREP-LipoEDIII免疫ICR小鼠,不加任何佐剂,再加强免疫2次后,通过ELISA检测血清中的抗体效价和细胞因子的分泌情况来评价其免疫效应。结果成功构建了含有"融合免疫佐剂Lipo多肽与包膜蛋白EDIII区"的重组甲病毒质粒DREP-LipoEDIII。DREP-LipoEDIII免疫小鼠后可以诱导产生特异性抗体,抗体效价为1∶160。抗原刺激小鼠脾淋巴细胞可以产生IFN-r、IL-4、IL-10细胞因子,实验组的浓度明显高于对照组。结论在不需要加入任何外源佐剂的情况下,本研究构建的融合免疫佐剂Lipo多肽的登革四价疫苗能够诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答,且以细胞免疫应答为主,为今后新型登革病毒四价疫苗的研究奠定了基础。

关键词：登革病毒包膜蛋白甲病毒载体四价疫苗

登革2型病毒PrM基因对不同型登革病毒复制的特异抑制作用

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军事医学科学院院刊 2002年第1期26卷 24-27页

作者：秦鄂德于曼赵月峨陈水平胡志君范宝昌段鸿元杨佩英军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅... 详细信息

目的 :将我国登革 2型病毒PrM(D2 _PrM)基因导入甲病毒载体系统 ,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用。方法 :采用体外转录和电穿孔的方法 ,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒。再将经激活的重组病毒感染宿主细胞 ,分别用不同型登革病毒攻击 ,然后通过免疫荧光法 ,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用。结果 :含登革 2型正、反义PrM基因的重组甲病毒 ,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制 ,而且对其他 3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用。含反义PrM基因的重组病毒对 4个型登革病毒复制的抑制作用最强。结论 :登革 2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒 ,可介导对登革 1～

关键词：甲病毒载体抗病毒作用登革2型病毒 PrM基因不同型登革病毒复制特异抑制作用

表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡安全性和免疫原性研究

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表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡安全性和免疫原性研究

作者：林楚晗华中农业大学

学位级别：硕士

狂犬病(Rabies virus,RABV)作为最古老的传染病之一,是由狂犬病病毒引起的几乎能感染所有哺乳动物的人畜共患病,其病死率几乎为100%,每年在世界范围导致约59,000人死亡,且绝大多数病例出现于发展中国家。疫苗接种是当前狂犬病防控的最... 详细信息

狂犬病(Rabies virus,RABV)作为最古老的传染病之一,是由狂犬病病毒引起的几乎能感染所有哺乳动物的人畜共患病,其病死率几乎为100%,每年在世界范围导致约59,000人死亡,且绝大多数病例出现于发展中国家。疫苗接种是当前狂犬病防控的最有效手段,但目前应用的狂犬疫苗的免疫原性不高且免疫程序复杂,因此研制安全、高效的狂犬病新型疫苗对狂犬病的防控意义重大。狂犬病病毒样囊泡是一种由赛姆利基森林病毒的RNA复制子与狂犬病病毒糖蛋白共同组成的载体,能够诱导小鼠产生与狂犬病弱毒疫苗相当的针对狂犬病毒的特异性免疫反应。我们前期研究发现,白细胞介素7(Interleukin 7,IL-7)作为佐剂可以提高狂犬病弱毒疫苗的免疫原性,并降低致病性。因此,本研究在狂犬病病毒样囊泡的基础上,拟构建表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡,并对其安全性和免疫原性开展研究,主要取得如下结果:我们首先通过反向遗传操作技术拯救表达增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,e GFP)的重组狂犬病病毒样囊泡,命名为rVLVs-e GFP-OptiG,通过荧光显微镜直接观察及间接免疫荧光的方法验证了外源蛋白e GFP可以被高效表达,且e GFP基因的插入不影响病毒样囊泡的遗传稳定性,这表明通过反向遗传操作技术表达外源蛋白的策略是可行性。在上述载体的基础上,我们进一步构建了表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡,并通过IFA鉴定了该重组病毒样囊泡已成功拯救,命名为rVLVs-mIL7-OptiG。同时,利用ELISA测得IL-7在rVLVs-mIL7-OptiG感染的BHK-21细胞中可以被成功表达并呈现剂量依赖性。细胞活性试验结果表明IL-7的表达不影响感染细胞的活性;生长曲线的测定结果表明,IL-7基因的插入不影响病毒样囊泡的体外增殖,且rVLVs-mIL7-OptiG经过10次连续传代后可以检测到IL-7基因以及IL-7的表达,表明该病毒样囊泡具有稳定遗传的特性。我们进一步对rVLVs-mIL7-OptiG的致病性和免疫原性进行了研究。我们将rVLVsmIL7-OptiG和rVLVs-e GFP-OptiG分别采用脑内注射途径感染成年小鼠和乳鼠,通过监测感染小鼠的生存情况、体重变化以及脑内的病毒载量,发现rVLVs-mIL7-OptiG感染后限制了病毒在脑内的增殖,从而提高重组狂犬病病毒样囊泡的安全性。在免疫原性研究中,我们发现rVLVs-mIL7-OptiG免疫小鼠后诱导的中和抗体水平与rVLVs-eGFPOptiG相当。综上所述,本研究成功构建并拯救了表达鼠源IL-7的重组狂犬病病毒样囊泡rVLVsmIL7-OptiG,其在小鼠模型中诱导的抗体水平与rVLVs-e GFP-OptiG所诱导的相当,且具有更高的安全性,为安全、高效的狂犬病新型疫苗的研究提供新的思路。

关键词：狂犬病疫苗甲病毒载体病毒样囊泡白细胞介素7 安全性

可复制型甲病毒颗粒疫苗的制备及其DC靶向化初步实验研究

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可复制型甲病毒颗粒疫苗的制备及其DC靶向化初步实验研究

作者：王宇中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

近年来,国际上逐步发展起了一种新的基因疫苗载体系统,称为复制型DNA疫苗,克服了常规DNA疫苗免疫力低下、安全方面不能保障的缺陷,同时又保留了DNA疫苗稳定、低成本的优点,因而成为开发治疗性疫苗最好的技术途径之一。本研究室前期自... 详细信息

近年来,国际上逐步发展起了一种新的基因疫苗载体系统,称为复制型DNA疫苗,克服了常规DNA疫苗免疫力低下、安全方面不能保障的缺陷,同时又保留了DNA疫苗稳定、低成本的优点,因而成为开发治疗性疫苗最好的技术途径之一。本研究室前期自主开发了基于塞姆利基森林病毒SFV的复制子DNA疫苗载体系统(可复制型DNA疫苗),并用于肿瘤疫苗及乙肝疫苗等新型治疗性基因疫苗的研究。所谓可复制型DNA疫苗,是在RNA复制子疫苗基础上发展演化而来的一种新型DNA疫苗系统。与常规DNA疫苗相比,可复制型DNA疫苗利用RNA复制酶,在细胞中具有自我复制能力,介导RNA复制子在细胞质中进行大量自我复制,因此外源基因可以得到高效表达。同时RNA大量自我复制过程中,产生的双链RNA是强效天然免疫佐剂,使可复制型DNA疫苗免疫效力远远高于常规DNA疫苗,用量可降低到传统DNA疫苗的100倍以下。再有,该疫苗的自我复制、转录表达均发生于细胞质中,最终会诱导被转染细胞凋亡,从而消除了与宿主细胞基因组整合的危险性,大大提高了基因疫苗的安全性。而且,这种疫苗以类似脉冲的形式刺激机体免疫系统,能够有效克服免疫耐受。为了进一步提高复制子DNA疫苗抗原的递送效率和免疫效果,本研究将复制子载体包装成为甲病毒颗粒样疫苗,同时还对所制备颗粒进行DC靶向化改造。病毒颗粒这种疫苗形式,除了具备复制子疫苗的全部优点外,还可以使其包装的复制子DNA免受核酸酶的降解,增强抗原进入细胞的效率,充分发挥病毒样颗粒本身的免疫学特性。同时,通过对这种重组的甲病毒颗粒疫苗进行DC靶向化改造,在体内选择性感染DC细胞,进一步增强DC细胞对抗原的吞噬、加工和递呈功能,从而提高疫苗激发特异性免疫应答的效果,最终提高疫苗的免疫效力。首先,本研究以基于SFV的含有红绿荧光蛋白报告基因的复制子DNA表达载体pSCK-EGFP-IRES-dsRED为基础,通过与辅助载体pSHCAR共转染,由pSHCAR提供结构蛋白,制备表达红绿荧光蛋白报告基因的重组病毒颗粒,并验证其表达能力。同时,通过实验,比较单独pSCK-EGFP-IRES-dsRED质粒和所制备的含有红绿荧光蛋白报告基因的重组病毒颗粒的表达能力。通过调整共转染时复制子表达载体和辅助载体的比例,并计算病毒滴度,初步摸索甲病毒包装的优化实验条件。通过检测报告基因的表达情况初步可以看出重组病毒颗粒表达效率比单独转染pSCK-EGFP-IRES-dsRED质粒要高,所制备的重组病毒滴度能够达到6.5×105IU/mL。通过对比在共转染时复制子DNA表达载体和辅助载体的摩尔比为1:1或者是质量比为1:1,经过检测红绿荧光蛋白报告基因,得出的实验结果是:共转染时可复制型DNA表达载体和辅助载体的质量比为1:1时,能得到更高滴度的病毒颗粒。在上述研究基础上,进一步对本室前期构建的HBV复制子DNA疫苗pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7进行病毒样颗粒化包装研究。将pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7质粒与辅助载体共转染BHK21细胞,收集细胞培养上清,制备HBV复制子病毒颗粒疫苗,并通过流式细胞仪和免疫荧光检测HBV复制子病毒颗粒疫苗的表达能力。初步结果可以看出,HBV复制子病毒颗粒疫苗能够在细胞中表达,经病毒滴度测定,制备的重组病毒滴度达到1.5×105 IU /mL。然后,我们借鉴国外的最新研究,以基于SFV(塞姆利基森林病毒)的可复制型病毒颗粒疫苗为基础,对其进行DCs靶向化研究。主要工作就是对基于SFV的辅助载体pSHCAR进行DC靶向化改造,使其辅助包装的病毒颗粒能特异性地结合DC表面分子DC-SIGN,从而实现病毒颗粒疫苗对DC细胞的特异性感染,进一步提高抗原递呈效率。最后对改造后的辅助载体进行表达和包装能力的初步验证。初步结果证实:改造后的辅助载体pSHCART具有较好的表达能力,通过RT-PCR检测手段证明改造后的辅助载体具有包装并形成病毒的能力,并且通过与复制子表达载体共转染能提高复制子表达载体的表达率。为了进行重组甲病毒颗粒体外DC靶向化实验研究,本实验还构建了能够稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。通过构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,将重组质粒转染BHK21细胞,以G418进行阳性克隆的筛选,通过有限稀释法筛选出稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western印迹及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达,最终成功构建了能稳定表达人DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为接下来DC靶向化重组甲病毒颗粒体外实验研究奠定了基础。该DC靶向可复制型甲病毒颗粒疫苗载体系统的最终研究成功,将在“颗粒化、内源化、高效化、靶向化”递呈抗原方面,具有不可比拟的技术优

关键词：甲病毒载体复制子DNA疫苗病毒样颗粒 DC-SIGN DC靶向化

猪热激蛋白Gp96N端基因与猪瘟病毒E2基因重组表达及重组蛋白的免疫原性研究

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猪热激蛋白Gp96N端基因与猪瘟病毒E2基因重组表达及重组蛋白的免...

作者：龚文芝中国兽医药品监察所

学位级别：硕士

猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)的囊膜糖蛋白,可诱导动物体产生有效的免疫保护,是研究新型疫苗的主要对象。有研究表明,Gp96N端结构区的构象有α螺旋沟,该区域与抗原肽结合能力强,形成的Gp96-抗原肽复合... 详细信息

猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)的囊膜糖蛋白,可诱导动物体产生有效的免疫保护,是研究新型疫苗的主要对象。有研究表明,Gp96N端结构区的构象有α螺旋沟,该区域与抗原肽结合能力强,形成的Gp96-抗原肽复合物非常稳定,有潜在的免疫佐剂作用。本研究将Gp96N(26AA-374AA)基因与E2全长基因通过口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)2A基因进行融合,然后分别采用真核和原核系统对该重组基因进行表达,并对原核表达的重组蛋白进行免疫原性的测定以探究Gp96N(26AA-374AA)蛋白与佐剂效果。首先,将甲病毒复制子载体p SFV1进行改造,加入真核CMV启动子和终止区SV40poly A序列,获得一新的表达载体p SCA,然后将EGFP基因、猪瘟病毒E2全长基因及Gp96N端与猪瘟病E2基因的融合片段分别克隆入p SCA载体中,获得p SCA-EGFP、p SCA-E2和p SCA-GE。转染后实验结果表明,p SCA-EGFP质粒能够得到有效表达,p SCA-E2、p SCA-GE能够得到表达,但是p SCA-E2、p SCA-GE质粒表达效率不高和平均荧光值偏低。其次,将E2基因与串联重组蛋白GE基因分别克隆入原核表达载体p ET-32a(+)中得到重组质粒p ET-E2和p ET-GE,转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中,分别诱导表达获得融合有组氨酸标签的重组蛋白E2和GE,随后对重组蛋白表达条件进行优化摸索最佳表达条件,并通过梯度尿素法对重组蛋白进行粗纯化和复性;采用SDS-PAGE和Western Blotting实验对目的蛋白进行检测,结果显示表达的重组蛋白为能与抗体特异性反应的目的蛋白。最后,为了研究重组蛋白E2、GE在动物体内的免疫原性,将原核表达的重组蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗以及PBS通过皮下注射免疫小鼠。通过ELISA实验检测免疫鼠血清中猪瘟病毒E2蛋白的抗体水平,结果表明:重组蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗组均产生较高的抗体水平,但是重组蛋白GE免疫组产生的抗体水平反而低于E2重组蛋白免疫组,由此说明Gp96N基因与E2基因串联经过原核表达后可能减弱重组蛋白的免疫效果,推测Gp96N基因与E2基因串联的位置关系可能会对原核表达的重组蛋白的免疫效果产生影响。

关键词：猪瘟病毒 E2 蛋白 Gp96N 基因甲病毒载体原核表达免疫原性

NDV F与ChIL-18融合基因“自杀性”质粒的构建

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安徽农学通报 2008年第5期14卷 21-24页

作者：刘勤妮聂奎西南大学动物科技学院重庆北碚400716

根据GeneBank公布的鸡新城疫病毒(NDV)Lasota株F基因和鸡源性白细胞介素18(ChIL-18)基因序列分别设计特异性引物,且在鸡NDV F基因引物上游引入BamHⅠ位点、下游引入SalⅠ位点,在Ch IL-18基因引物上游引入SalⅠ位点、下游引入HindⅢ、Bam... 详细信息

根据GeneBank公布的鸡新城疫病毒(NDV)Lasota株F基因和鸡源性白细胞介素18(ChIL-18)基因序列分别设计特异性引物,且在鸡NDV F基因引物上游引入BamHⅠ位点、下游引入SalⅠ位点,在Ch IL-18基因引物上游引入SalⅠ位点、下游引入HindⅢ、BamHⅠ位点。以鸡新城疫病毒Lasota株RNA为模板RT-PCR扩增其F基因,将F基因插入pMD18-T的BamHⅠ与SalⅠ位点中。同时扩增上游带有SalⅠ位点、下游带有HindⅢ、BamHⅠ位点的ChIL-18基因,并将其插入到含有F基因的pMD18-T质粒的SalⅠ、HindⅢ位点之间,从而使NDV F基因与ChIL-18基因形成具有一个完整阅读框的融合基因,然后将融合基因片段定向克隆到pSFV单一启动子(CMV)下游,构建成F-ChIL-18融合基因重组"自杀性"质粒pSFV-F-ChIL-18。

关键词：鸡新城疫病毒F基因鸡源性白细胞介素18 甲病毒载体核酸疫苗