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水牛瘤胃甲烷菌的区系分析、分离培养与基因组测序研究

水牛瘤胃甲烷菌的区系分析、分离培养与基因组测序研究

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作者： Muhammad Wasim Iqbal 广西大学

学位级别：硕士

本文探究了水牛和娟姗牛的瘤胃产甲烷菌数量和菌群结构的差异,及不同饲料原料对瘤胃微生物菌群中物种的影响;在此基础上采用Hungate滚管技术分离培养了 3株甲烷菌,并对其中一株进行了基因组测序分析。试验第一部分,分别选取4头体重相似... 详细信息

本文探究了水牛和娟姗牛的瘤胃产甲烷菌数量和菌群结构的差异,及不同饲料原料对瘤胃微生物菌群中物种的影响;在此基础上采用Hungate滚管技术分离培养了 3株甲烷菌,并对其中一株进行了基因组测序分析。试验第一部分,分别选取4头体重相似的瘤胃瘘管水牛和娟姗牛,饲喂相同的日粮,30天后采集瘤胃液体用于测定瘤胃甲烷菌数量和菌群结构组成。结果显示两种牛之间瘤胃甲烷菌数量无显著差异(P>0.05).Methnobrevibacter(甲烷短杆菌)是最主要的甲烷菌属,***是优势菌属,且其在娟姗牛瘤胃中丰度较高(P甲烷菌数量和菌群结构组成均不相同。此外,我们用体外发酵产气法评估了 4种典型亚热带饲料(玉米秸秆青贮、象草、木薯渣和青贮甘蔗尾)对体外发酵条件下水牛瘤胃甲烷菌菌群结构的影响。结果表明体外发酵的4种底物未显著影响甲烷菌数量(P>0.05),***为各组甲烷菌的优势菌群;木薯渣和青贮甘蔗尾中相对丰度最高的分别为***和***;而青贮甘蔗尾中的Methanomassiliicoccale丰度显著高于其它几个组(P甲烷菌产生了影响,且青贮甘蔗尾可作为Methanomassiliicoccale属甲烷菌的富集底物。为分析水牛瘤胃甲烷菌的基因组特点,本研究采用采用Hungate滚管技术和BY培养基来分离培养水牛瘤胃甲烷菌。首先,将甲烷菌底物与水牛瘤胃液一并加入到Hungate管中进行厌氧培养,再采用滚管法对不同甲烷菌菌株进行分离,挑去单菌落后再进行多轮分离纯化。甲烷菌的生长情况用气相色谱测定甲烷来评定,纯化程度采用细菌特异性PCR法进行检测。最终,经过固体与液体培养基的多轮分离培养,我们得到了三株甲烷菌纯菌株,经过16sRNA基因测序分析发现这三株菌分别属于Methanomicrobiales和Methanosarcinales属。在此基础上,我们采用热处理与抗生素添加的方式,对这三株菌进行驱除细菌试验,经过细菌特异性PCR检测,发现其中一株菌*** Wasimlinii菌液中未检出细菌特异性基因片段,表明该菌株已经驱除了细菌,得到了纯化。对*** Wasimlinii的生长特性分析表明,该菌株可利用甲酸和氢气生成甲烷,最适生长pH值为7。该菌株采用500ml的血清瓶扩大培养后,提取DNA进行高通量测序分析表明*** Wasimlinii的基因组大小为2801723bp,其中编码区段为2426127bp。采用数据库对基因组注释后表明,该菌基因组共包含2830个基因,其中2787为蛋白质编码基因,基因平均长度为857bp,且不含任何致病基因。

关键词：大气甲烷瘤胃甲烷菌水牛瘤胃区系分析分离培养甲烷菌基因组

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