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中国实验血液学杂志 2015年第3期23卷 713-717页

作者：王昭牛小青周雯雯鹿全意厦门大学附属中山医院血液科福建医科大学教学医院福建厦门361004

目的:探讨DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase,DNMT1)基因沉默对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞内细胞因子信号转导抑制分子1(suppressor of cytokine signaling,SOCS-1)甲基化的影响。方法:应用靶向沉默DNMT1基因的短发卡RNA(RNA-Short hairpin RNA,shRNA)通过脂质体(lipofectamineTM2000)介导转染骨髓瘤细胞RPMI8226,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测转染前后DNMT1基因和蛋白表达,应用甲基化特异性PCR检测转染前后骨髓瘤细胞SOCS-1基因甲基化水平的变化。结果:转染后骨髓瘤细胞DNMT1 mRNA表达水平(0.176±0.004)和蛋白表达水平(0.065±0.014)均明显低于阴性对照组(0.956±0.033,0.415±0.027),其差异具有统计学意义(P甲基化水平较转染前明显降低。结论:利用shRNA能靶向沉默DNMT1基因的表达,并可以有效逆转SOCS-1基因高甲基化状态。

关键词：多发性骨髓瘤 RNA干扰甲基化转移酶1 SOCS-1基因

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RNAi沉默DNMT1基因对胰腺癌细胞ppENK甲基化状态的影响

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临床与实验病理学杂志 2013年第1期29卷 28-31页

作者：卜淑蕊钱家鸣中国医学科学院、北京协和医学院、北京协和医院消化内科北京100730

目的观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默DNMT1基因的表达对胰腺癌Panc-1细胞的前脑啡肽原(preproen-kephalin,ppENK)基因甲基化状态的影响。方法采用针对DNMT1的Stealth核糖核苷酸干扰(siRNA)胰腺癌细胞,观察DN-MT1信使核糖核酸(mRNA)及DNMT1蛋白的表达;甲基化特异性PCR反应(MSP)检测不同处理组ppENK的甲基化状态。结果 Stealth RNAi转染到胰腺癌细胞Panc-1中48 h后,siRNA-3转染组的mRNA相对表达量和比率分别为0.116和32.9%,与空白对照组(0.352,100%)、脂质体对照组(0.346,98.2%)、RNAi阴性对照组(0.339,96.3%)相比差异有统计学意义(F=2.107 E4,P=0.000 1),转染组的mRNA相对抑制率为67.1%。siRNA-3转染组DNMT1蛋白相对表达量和比率分别为0.179和32.9%,与空白对照组(0.547,100%)、脂质体对照组(0.520,95%)、RNAi阴性对照组(0.535,97%)相比差异有统计学意义(F=2.195 E5,P=0.000 1)。于100 bp和96 bp处可见ppENK基因特异性条带,呈现部分去甲基化状态的特点。结论 DNMT1靶向的Stealth RNA瞬时转染到胰腺癌细胞Panc-1中可明显沉默DNMT1的基因和蛋白的表达,逆转抑癌基因ppENK的高甲基化状态,为胰腺癌的基因治疗提供相关的理论依据。

关键词：胰腺肿瘤 RNA干扰甲基化转移酶1 前脑啡肽原甲基化

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褪黑素调控DNA甲基化对人增生性瘢痕成纤维细胞转化的影响

褪黑素调控DNA甲基化对人增生性瘢痕成纤维细胞转化的影响

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作者：张益勋暨南大学

学位级别：硕士

第一部分褪黑素对人增生性瘢痕成纤维细胞DNA甲基化的影响目的:探讨褪黑素对人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)DNA甲基化的影响方法:1.收集人增生性瘢痕组织12例,组织块法分离培养取第4代人增生性瘢痕成纤维细胞,用免疫细胞化学法(ICC)鉴定... 详细信息

第一部分褪黑素对人增生性瘢痕成纤维细胞DNA甲基化的影响目的:探讨褪黑素对人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)DNA甲基化的影响方法:1.收集人增生性瘢痕组织12例,组织块法分离培养取第4代人增生性瘢痕成纤维细胞,用免疫细胞化学法(ICC)鉴定成纤维细胞。2.酶消化法消化细胞,接种于96孔板中,分别加入不同浓度褪黑素组(0、1x10、1x10、1mmol/L)。分组培养48h后,采用细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(WST-1)检测成纤维细胞增殖活性,倒置显微镜观察其形态变化,选取合适浓度的褪黑素实验组作为后续实验组用药浓度;3.实验分成两组:(1)对照组:细胞消化传代后,加入4ml FBS,培养48h;(2)褪黑素组:细胞消化传代后,加入含有褪黑素浓度为10mmol/L的10%FBS 4ml,培养48小时后收集细胞;采用荧光定量聚合酶反应(realtime fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)和免疫印迹法(Western Blot)检测对照组与褪黑素组间成纤维细胞DNMT1 mRNA的表达量和DNMT1蛋白的含量;结果:1.成纤维细胞形态学观察及鉴定组织块法培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,倒置相差显微镜观察,细胞呈旋涡状或者鱼群样生长特点,细胞核呈类圆形,胞体呈扁平多角形或者梭形,ICC法观察:DAB染色示:细胞突起较多,呈多角星形或纺锤形,细胞体积大,胞质呈棕黄色。成纤维细胞中波形蛋白(Vimentin)呈阳性表达。2.不同褪黑素浓度对HSFB生长形态的影响倒置相差显微镜下观察不同浓度褪黑素对成纤维细胞生长状态的影响,不同浓度褪黑素作用下成纤维细胞形态规则,呈鱼群集落样生长。不同浓度褪黑素对增生性瘢痕成纤维细胞生长形态无影响,提示褪黑素对成纤维细胞的活性没有直接的毒害作用。3.不同褪黑素浓度对HSFB增殖的的影响 WST-1结果显示:(1)对照组和褪黑素浓度为1x10mmol/L组相比,成纤维细胞的增殖活力无统计学意义(P>0.05);(2)与对照组相比,褪黑素浓度为1x10、1mmol/L对人瘢痕成纤维细胞的增殖具有抑制作用,成纤维细胞增殖活力明显低于对照组,差异有统计学意义(P1mmol/L与浓度为1x10、1x10mmol/L的褪黑素组相比,差异均有统计学意义(P10mmol/L作为后续实验组用药浓度.4.褪黑素对HSFB中DNMT1 mRNA表达及蛋白含量的影响 RT-PCR检测显示褪黑素组DNMT1 mRNA表达量为1.86±0.094,明显高于对照组DNMT1 mRNA(1.00±0.082)表达量(P1蛋白含量为0.20±0.066,高于对照组DNMT1蛋白含量(0.12±0.062)(P1.不同浓度褪黑素对人增生性瘢痕成纤维细胞的活性无影响;2.褪黑素可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖;3.褪黑素可以提高人增生性瘢痕成纤维细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达,提示褪黑素可以提高人增生性瘢痕成纤维细胞DNA甲基化的水平。第二部分褪黑素对去甲基化作用后的人增生性瘢痕成纤维细胞转化的影响目的:探讨褪黑素对去甲基化作用后的人增生性瘢痕成纤维细胞转化的影响方法:收集人增生性瘢痕组织8例,组织块法分离培养取第4代人增生性瘢痕成纤维细胞,实验分成四组:(1)单纯培养基组;(2)褪黑素组(浓度为1x10mmol/L);(3)褪黑素+地西他滨(DAC)组;(4)DAC组;培养48h后,采用Western Blot法检测各组间α-SMA蛋白的含量变化。结果:Western Blot法结果显示褪黑素组α-SMA含量为0.63±0.148;褪黑素+DAC组α-SMA含量为0.44±0.267;DAC组α-SMA含量为0.48±0.167,均低于单纯培养基组(0.87±0.089)α-SMA蛋白水平,差异均有统计学意义(P0.05);褪黑素+DAC组与DAC组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.褪黑素可以减少人增生性瘢痕成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达;2.甲基化酶抑制剂(DAC)可减少增生性瘢痕成纤维细胞中α-SMA蛋白的表达。

关键词：褪黑素 DNA甲基化增生性瘢痕甲基化转移酶1 α平滑肌激动蛋白

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Stealth核糖核苷酸干扰抑制胰腺癌细胞DNMT1表达的研究

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中国临床医学 2011年第6期18卷 757-760页

作者：卜淑蕊钱家鸣中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院消化内科北京100730 复旦大学附属金山医院消化科

目的:研究靶向甲基化转移酶1(DNMT1)基因的Stealth核糖核苷酸干扰(RNAi)技术对胰腺癌细胞Panc-1中DNMT1表达的抑制作用。方法:通过Block-IT TMRNAi Designer在线设计合成针对DNMT1的Stealth核糖核苷酸(siRNA),以50 nM siRNA用脂质体转... 详细信息

目的:研究靶向甲基化转移酶1(DNMT1)基因的Stealth核糖核苷酸干扰(RNAi)技术对胰腺癌细胞Panc-1中DNMT1表达的抑制作用。方法:通过Block-IT TMRNAi Designer在线设计合成针对DNMT1的Stealth核糖核苷酸(siRNA),以50 nM siRNA用脂质体转染法转染Panc-1细胞。同时设空白对照组,RNAi阴性对照组,荧光RNAi组,每组3个复孔;在转染24 h、48 h、72 h后用荧光显微镜观察转染效率,以48 h荧光强度最亮。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测DMNT1信使核糖核酸(mRNA)含量,免疫印迹(Westem blot)检测DNMT1蛋白的表达。结果:将靶向DNMT1基因Stealth RNAi转染到胰腺癌细胞Panc-1中后,Panc-1细胞在转染RNAi后48 h的转染效率为50%～60%;DNMT1的蛋白和mRNA水平显著下调,与对照组相比,转染后48 h的相对抑制率分别为68%和67.8%(P<0.05),也显著低于空白对照组及空载体组(P<0.05)。结论:DNMT1靶向的Stealth RNA瞬时转染到胰腺癌细胞Panc-1中可显著沉默DNMT1的基因和蛋白的表达,为胰腺癌的基因治疗提供新的理论依据。

关键词：胰腺癌 RNA干扰甲基化转移酶1

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