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DNA甲基化影响蓝莓果实花青苷积累机制初探

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DNA甲基化影响蓝莓果实花青苷积累机制初探

作者：邵楠浙江师范大学

学位级别：硕士

DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制,在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因的功能。植物中主要包括四种胞嘧啶甲基转移酶:维持DNA甲基转移酶METs家族、结构域重组甲基化酶DRMs、染色质甲基化酶CMTs与DNA甲基转移酶Dnmt2家族。花青... 详细信息

DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制,在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因的功能。植物中主要包括四种胞嘧啶甲基转移酶:维持DNA甲基转移酶METs家族、结构域重组甲基化酶DRMs、染色质甲基化酶CMTs与DNA甲基转移酶Dnmt2家族。花青苷是蓝莓主要的代谢产物之一,具有重要的营养和市场价值。目前有关蓝莓花青苷研究主要集中在合成路径调控与代谢、提取方法的改进等,鲜有关于DNA甲基化和去甲基化基因对花青苷生物合成的影响。本实验选取南高丛蓝莓品种’奥尼尔’和’蓝雨’为研究试材,分离DNA甲基化、去甲基化以及花青苷合成相关基因,采用实时荧光定量法(qPCR)分析各基因在果实生长发育阶段的表达水平,通过比较转色期前后花青苷含量差异,以及花青苷合成关键基因启动子中的甲基化变化,分析DNA甲基化和去甲基化基因对花青苷生物合成可能的影响。具体研究结果如下:(1)分别分离出蓝莓DNA甲基化基因VcMET1、VcDRM2、VcCMT3和去甲基化基因VcDME1cDNA序列各一条。分析推导的氨基酸序列发现,4个基因均包含植物中高度保守的结构域:VcMETl包含2个N端调控区的复制叉作用位点DNMT1-RFD结构域,2个参与DNA甲基化、复制与转录调控的BAH及1个胞嘧啶甲基转移酶Dcm结构域;VcDRM2包含1个泛素相关结构域UBA与1个S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶结构域;VcCMT3分别包含1个BAH、Dcm及染色质结构修饰结构域CHROMO;VcDMEI分别包含1个RRMME,一个编码螺旋发夹结构的HHH super family以及一个可被Demeter-like蛋白探测的Perm-CXXC蛋白结构域。qPCR分析发现,VcMET1和VcCMT3随着果实的发育表达量逐渐下降,在果实发育的后期甚至检测不到;除在’蓝雨’ S6和S7期高表达外,VcDRM2在整个果实发育期间mRNAs相对较低,且呈平缓下降状态;与DNA甲基化基因类似,去甲基化基因VcDME1在果实发育时期阶段的表达也呈现下降趋势。(2)根据报道的蓝莓花青苷合成相关基因VcANS、FcDFR、VcCHS、VcF3H和VcUFGT基因序列,分离并研究这些基因在’奥尼尔’与‘蓝雨’果实发育进程中的表达模式,发现其表达模式上高度一致,呈现上升-下降-上升-下降的动力学变化趋势。(3)蓝莓果实中花青苷主要积累在果皮,果实从S5期开始积累花青苷,随后花青苷含量迅速增加;S5期果实呈白色或浅绿色,Br期1/4的蓝莓果实呈浅红或浅紫色,到S6期果实转变成深蓝色。pH示差法分析表明3个时期花青苷的含量分别是0.005、0.22和2.63 mg/g.FW。比较同时期花青苷生物合成相关基因的表达,发现这些基因在花青苷积累之前表达丰度较高,花青苷的积累对其基因表达呈现反馈调控。(4)采用同源克隆法分离出’奥尼尔’与’蓝雨’花青苷合成相关基因VcANS、VcDFR、VcCHS、VcF3HccUFGT启动子序列;利用启动子分析软件PlantCARE预测发现,光响应元件占40.30%,推测蓝莓花青苷生物合成受光信号影响较大。(5)对花青苷合成相关基因VcANS和FcCHS启动子序列的胞嘧啶变化分析发现,VcANS启动子从S5期-Br期-S6期中分别有2个、10个和8个胞嘧啶被甲基化,在转色期前后仅在3个转录起始位点(两个TATA-box和一个CAAT-box)发生改变;VcCHS启动子从S5期-Br期-S6期中分别有2个、2个和4个胞嘧啶被甲基化;另外,VcANS和VcCHS启动子甲基化位点分别存在序列反义链上的CAAT-box区域和5’-UTR Py-rich stretch区域,属于高转录水平的顺式作用元件,影响花青苷相关基因的转录表达,推测低甲基化状态下的启动子序列促进基因的表达。

关键词： DNA甲基化花青苷合成相关基因花青苷含量甲基化程度

MS_(3)RNA在小鼠胚胎癌细胞中特异表达的可能机理

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Zoological Research 1984年第2期5卷 139-144,I0002页

作者：许以盛 P.勃吕莱中国科学院昆明动物研究所法国巴黎巴斯德研究所细胞遗传学处

MS_(3) RNA是小鼠胚胎癌细胞特异RNA。为了阐明MS_(3)基因在未分化细胞中特异表达的机理,我们应该首先确定此特异表达是在哪一级水平上被调控的。Naveh-Many等(1981)指出积极进行转录的基因一般是甲基化程度不足的。由于MS_(3)基因有一... 详细信息

MS_(3) RNA是小鼠胚胎癌细胞特异RNA。为了阐明MS_(3)基因在未分化细胞中特异表达的机理,我们应该首先确定此特异表达是在哪一级水平上被调控的。Naveh-Many等(1981)指出积极进行转录的基因一般是甲基化程度不足的。由于MS_(3)基因有一个中等重复的家族,因此如果MS_(3)基因的调控主要在转录水平上进行,我们应该发现MS_(3)基因的甲基化程度在分化细胞及未分化细胞之间有明显差别,于是用测定甲基化程度的一组酶HpaⅡ和Msp1水介代表分化细胞的TDM_(1)及代表未分化细胞的F_(9)的高分子量DNA,然后用MS_(3) cDNA作探针分析MS_(3)基因区的甲基化程度。在可用MS_(3) cDNA探查到的范围内,MS_(3)基因区的甲基化程度在TDM_(1)及F_(9)细胞中未见明显不同。对这一结果可有四种不同解释:1.MS_(3)基因家族中除少数成员外其余绝大部分成员在未分化细胞中是不转录的,在分化细胞中则全部不转录:2.MS_(3)基因家族的绝大部分成员在未分化细胞以及在分化细胞中都是转录的;3.虽然MS_(3)基因家族中的绝大部分成员都是不转录的,但个别成员在未分化细胞以及分化细胞中都是转录的;4.由于MS_(3) cDNA只能探查MS_(3)基因的分端区域,可能此区域的甲基化程度与MS_(3)基因的转录水平无关。为了区别这些可能性,我们检查了F_(9)细胞及TDM_(1)细胞中的核RNA,发现在这二种细胞核内都存在若数量几乎相等的大量MS_(3)基因转录物。因此我们推断,MS_(3)基因家族中至少有一部分成员,很可能是大部分成员,不论在未分化细胞还是在分化细胞中都是转录的。在色分化细胞的细胞质中不能探查到MS_(3)RNA的原因可能在于MS_(3)基因在转录后水平上的调控,即在已分化细胞的核内缺乏加工MSRNA前体的能力或缺乏把成热的MS_(3) RNA从细胞核输送到细胞质中去的能力。

关键词：未分化细胞探针分析小鼠胚胎甲基化程度癌细胞可能机理基因转录 TDM

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PLC/PRF/5人肝癌细胞系的研究概况

国外医学(微生物学分册) 1984年第6期 248-251页

作者：杨月庄辉北京第二传染病医院肝炎病毒研究室北京医学院流行病学教研室

1976年Alexander等从莫桑比克一名原发性肝癌男性患者(该患者同时伴有HBsAg血症)分离到一株人肝癌细胞系,代号为PLC/PRF/5(以下简称PLC)。近年来,国内外许多实验室对此细胞系进行了多方面的研究,取得了一定的进展。现分几个问题综述如下:

关键词：人肝癌细胞系 PLC/PRF/5 原发性肝癌问题综述甲基化程度甲胎蛋白 HBSAg HBcAg 乙型肝炎病毒 DNA

老年女性结直肠癌分子标记物和通路与临床病理特征的相关性研究

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消化肿瘤杂志（电子版） 2013年第3期5卷 146-146页

作者： Samadder NJ Vierkant RA Tillmans LS 张信华

背景和目的结直肠癌具有明显异质性,其发病通常来自一系列遗传事件和表观遗传学事件的不同组合。越来越多证据支持根据微卫星不稳定(MSI)情况、Cp G岛甲基化表型、体细胞BRAF及KRAS基因突变情况将结直肠癌分为不同亚型。例如,与微卫星... 详细信息

背景和目的结直肠癌具有明显异质性,其发病通常来自一系列遗传事件和表观遗传学事件的不同组合。越来越多证据支持根据微卫星不稳定(MSI)情况、Cp G岛甲基化表型、体细胞BRAF及KRAS基因突变情况将结直肠癌分为不同亚型。例如,与微卫星稳定或MSI程度低的结直肠癌患者相比,MSI程度高的患者近侧结肠癌更常见,伴高级别分化和临床分期较晚,且淋巴转移更常见;Cp G岛甲基化程度高者与高龄患者、近侧结肠癌、肿瘤低分化及MSI程度高相关。KRAS突变(特别是密码子12和13突变)者,更常见于Cp G岛甲基化程度低伴微卫星稳定或MSI程度低以及BRAF突变阴性的结直肠癌。本研究目的在于利用人口基数为爱荷华州女性的健康调查的大样本研究(n=41 836),验证结直肠癌患者临床病理特征及生存时间与分子分型之间的相关性。方法从已建档的732例结直肠肿瘤患者取样并评估其特征,区分微卫星稳定或微卫星不稳定性程度的高低、Cp G岛甲基化程度高低或Cp G岛甲基化表型阴性以及BRAF和/或KRAS突变状态。563(77%)例肿瘤患者中收集到信息标记物数据,分别归纳为下列整合通路。经典型(微卫星稳定、Cp G岛甲基化表型阴性、BRAF突变阴性以及KRAS突变阴性,n=170);替换型(微卫星稳定、Cp G岛甲基化表型程度低、BRAF突变为阴性并KRAS突变阳性,n=58);锯齿型(任何程度的微卫星不稳定、Cp G岛甲基化程度高、BRAF突变为阳性并KRAS突变阴性,n=142);未分类型(n=193)。多变量Cox比例风险回归模型用于评估指标间的相关性。结果患者平均年龄(P=0.03)、肿瘤部位(P=0.0001)和分级(P=0.0001)与整合路径显著相关。结直肠癌患者死亡率与经典路径、替换路径和锯齿型路径并无明显相关性,而与未分类路径下面的亚型(微卫星稳定或微卫星不稳定性程度低、Cp G岛甲基化阴性、BRAF突变阴性、KRAS突变阳性)有关(n=96,与经典型路径相比较,RR=1.76,95%CI:1.07~2.89)。结论结直肠癌患者临床病理特征与分子分型之间存在明显相关性。这些分子变化特征如何影响预后还需要进一步研究。

关键词：结直肠癌微卫星近侧结肠癌甲基化程度分子标记物分子分型锯齿型结直肠肿瘤异质性淋巴转移

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粪便DNA测试对确定大肠癌很有希望

中华医学信息导报 2004年第13期19卷 7-7页

作者：李立

测试粪便DNA的甲基化变化可能是筛查结肠直肠癌的一项有用的方法。这项新的研究表明，在确定结肠直肠癌的患者中，一种称作SFRP2基因的甲基化程度的灵敏度达到了90%。

关键词：粪便检查 DNA测试大肠癌 SFRP2基因甲基化程度