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血管瘤中血管内皮生长因子受体KDR基因异常甲基化的研究

血管瘤中血管内皮生长因子受体KDR基因异常甲基化的研究

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作者：杨恩泸州医学院

学位级别：硕士

目的:本研究拟通过建立甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法(MS- HRM)检测血管内皮生长因子VEGF受体KDR基因启动子区域在不同时期血管瘤、血管畸形及正常皮肤组织等中的甲基化状态,初步探讨基因甲基化在血管瘤形成、增生、退化过程中的作用... 详细信息

目的:本研究拟通过建立甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法(MS- HRM)检测血管内皮生长因子VEGF受体KDR基因启动子区域在不同时期血管瘤、血管畸形及正常皮肤组织等中的甲基化状态,初步探讨基因甲基化在血管瘤形成、增生、退化过程中的作用。方法:选取不同时期血管瘤石蜡标本48例、血管畸形石蜡标本15例、正常包皮皮肤组织标本8例,分别提取DNA,经亚硫酸氢盐甲基化修饰、纯化、回收DNA,以QIAGEN公司的全基因组甲基化DNA作为100%甲基化标准品,与100%非甲基化健康孕妇脐带血DNA按比例混合,稀释制成0%、5%、25%、50%、75%、100%系列浓度甲基化DNA标准品,将甲基化标准品经过PCR扩增后进行MS‐HRM溶解曲线检测获得标准曲线,并进行重复性和灵敏度评价。然后用甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法(MS-HRM)定量检测增生期血管瘤24例、消退期血管瘤24例,血管畸形15例,正常包皮皮肤组织8例等标本中血管内皮生长因子受体KDR甲基化水平。结果:成功制成的100%、75%、50%、25%、5%、0%甲基化标准曲线依次从右往左排列,经过三次重复检测,曲线基本重叠一致;经过MS‐HRM检测,48例血管瘤标本共检出32例不同程度KDR基因启动子区域甲基化(66.67%),其中24例增殖期血管瘤标本中检出21例(21/24,87.50?%)不同程度甲基化,1例甲基化程度为0?%～5%,?11例甲基化为25?%～50%,5例甲基化为75?%,4例甲基化为100%;24例消退期血管瘤标本中检出11例(11/24,45.83?%)不同程度甲基化,其中,1例甲基化程度为75?%,8例甲基化为25?%～50?%,2例甲基化为0%～5%,增殖期血管瘤与消退期血管瘤标本中KDR的甲基化程度比较差异显著,具有统计学意义(χ2=8.889,P甲基化程度为0%～25%2例(2/15,13.?33%),8例正常包皮皮肤组织中检测到1例甲基化0%～5%(1/8,12.50%)。与血管瘤相比,差异均具有统计学意义(P率法);消退期血管瘤与血管畸形中KDR的甲基化程度比较有显著差异,具有统计学意义(p=0.45,Fisher’确切概率法)。结论:①血管瘤中血管内皮生长因子受体KDR基因启动子序列CpG岛存在异常甲基化,血管内皮生长因子受体KDR基因异常甲基化可能与血管瘤增生、退化等有关;②MS‐HRM技术定量检测血管瘤中KDR甲基化程度的方法操作简单,灵敏度高,成本低,可重复性强,为进一步研究血管瘤组织中基因异常甲基化建立了一种检测方法。

关键词：血管瘤血管内皮生长因子受体甲基化甲基化敏感性高分辨率溶解曲线法

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