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NYD-SP15转基因小鼠的构建和表型分析及RPAP3和TTC21A蛋白中TPR结构域功能的研究

NYD-SP15转基因小鼠的构建和表型分析及RPAP3和TTC21A蛋白中TPR结...

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作者：李靓云南京医科大学

学位级别：硕士

背景&目的：脱氨酶基因是一个古老而又崭新的酶类超家族，已发现该家族很多新成员，不同的是RNA和DNA中胞苷脱氨作用的改变。该家族许多成员与病毒感染、肿瘤发生、肿瘤耐药和机体免疫相关。NYD-SP15是我们新发现的具有胞苷脱氨酶结构... 详细信息

背景&目的：脱氨酶基因是一个古老而又崭新的酶类超家族，已发现该家族很多新成员，不同的是RNA和DNA中胞苷脱氨作用的改变。该家族许多成员与病毒感染、肿瘤发生、肿瘤耐药和机体免疫相关。NYD-SP15是我们新发现的具有胞苷脱氨酶结构域、进化上与其他胞苷脱氨酶成员有着密切联系的蛋白。本研究构建了过表达人源SP15蛋白的转基因小鼠，并从生理和病理水平研究过表达后对小鼠发育的影响，初步阐明了NYD-SP15在生物体上的功能。方法：通过原核注射，构建全身性表达NYD-SP15的转基因小鼠;将获得的NYD-SP15转基因小鼠与C57/BL6小鼠交配，获得稳定表达的子代;运用定量PCR和Western blot技术，检测阳性小鼠NYD-SP15的表达水平;长期观察阳性转基因小鼠的体重、形态变化，使用生化分析仪检测小鼠血液系统指标的改变，运用小动物活体Carestream MS FX PRO系统X-Ray对小鼠进行研究，从生理水平检测NYD-SP15转基因小鼠的变化;解剖转基因小鼠，取各脏器切片染色后观察细胞组织学的改变。结果：获得3只阳性NYD-SP15F0代小鼠，与C57/BL6小鼠交配后，检测子代小鼠NYD-SP15的表达情况;转基因小鼠相对于野生型而言NYD-SP15的mRNA水平普遍升高，且脑部和肺脏中表达最高;Flag抗体的western实验显示转基因小鼠中NYD-SP15蛋白的普遍高表达，但在胰脏和脑组织中表达量较少;虽然大多数转基因小鼠在72周龄时仍表现出正常的存活能力，但4阳性转基因小鼠在52周龄时即表现出一系列不正常的生理学变化;使用小动物活体Carestream MS FX PRO系统进行X-Ray拍摄，发现4小鼠腹部明显比野生对照肥大;收集小鼠的血液进行生化仪分析，发现许多生理学指标发生明显的改变;解剖观察4小鼠腹部完全被大面积的白色脂肪所填充，所有脏器均比同年龄的野生型小鼠大，并且胃与脾脏接合处发现一个多出的肉瘤状物质，染色后发现是一个似脂肪瘤的组织;组织切片染色观察发现肝脏、肺脏及多出的肉瘤组织(后证实为脂肪)有肉眼可见的病变反应;本研究说明NYD-SP15的过表达会导致上皮组织，包括肝脏、肺脏在内的病变的发生。结论：NYD-SP15转基因小鼠在全身的表达效率不一;不是所有转基因小鼠都有异常表型产生，所有阳性转基因小鼠中只有其中的一部分会产生特殊生理学和病理学改变;4阳性小鼠的生理学指标有明显的异常，病理组织切片显示肝、肺和脂肪等主要组织有严重的组织学改变，说明NYD-SP15可能与其他的胞苷脱氨酶家族成员一样，是潜在的原癌基因。背景&目的：研究RPAP3和TTC21A蛋白的TPR结构域与热休克蛋白70是否存在相互作用;构建针对RPAP3TPR区域的慢病毒载体，观察过表达对细胞周期的影响。方法：通过生物信息学软件比较RPAP3和TTC21A结构域组成，推测功能;通过酵母双杂交实验研究RPAP3和TTC21A与HSP70的相互作用及作用靶点;构建慢病毒载体pLJM.1-RPAP3，转染293T细胞，收病毒感染MCF7细胞，嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞系，流式细胞分析对细胞周期的影响。结果：RPAP3和TTC21A在多物种广泛存在，有高度保守性;酵母双杂交实验证实RPAP3及TTC21A与HSP70间存在相互作用，且作用发生在三联TPR结构域和HSP70的GPTIEEVD末端之间;流式细胞显示RPAP3和TTC21A的TPR区域高表达会阻滞细胞周期且凋亡增加。结论：RPAP3及TTC21A与HSP70间的相互作用发生在三联TPR结构域和热休克蛋白70的GPTIEEVD末端之间;构建高表达细胞株发现其对细胞周期及凋亡有影响。

关键词：胞苷脱氨酶 NYD-SP15 表达效率生理病理学改变 TPR结构域蛋白相互作用稳定细胞系细胞周期

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