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奶酪中挥发性硫化物的风味贡献、检测方法及其生物合成调控的研究进展

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食品安全质量检测学报 2022年第18期13卷 5779-5785页

作者：陈臣聂航鑫于海燕黄娟娄新曼田怀香上海应用技术大学香料香精技术与工程学院上海201418

奶酪中的挥发性硫化物主要包括甲硫醇、硫化氢、二甲基硫醚、二甲基二硫醚、甲硫基丙醛等,是奶酪关键气味物质之一,对于奶酪整体风味的形成有着重要贡献。本文在查阅相关文献的基础上,对常见奶酪中挥发性硫化物的组成、香气贡献进行了... 详细信息

奶酪中的挥发性硫化物主要包括甲硫醇、硫化氢、二甲基硫醚、二甲基二硫醚、甲硫基丙醛等,是奶酪关键气味物质之一,对于奶酪整体风味的形成有着重要贡献。本文在查阅相关文献的基础上,对常见奶酪中挥发性硫化物的组成、香气贡献进行了系统的综述,介绍了奶酪中测定挥发性硫化物的常用方法及其优缺点;总结了奶酪中挥发性硫化物的形成机制及生物合成调控策略,包括菌种筛选、微生物搭配组合、基因工程技术。最后对当前研究中存在的问题及未来研究方向做了归纳与展望。为全面认知奶酪中挥发性硫化物风味及其形成和调控,开发更适合国人口味的奶酪产品和中国奶酪产业的转型升级提供理论参考。

关键词：奶酪挥发性硫化物风味贡献生物合成调控

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喜树碱生物合成调控的研究进展

分子植物育种 2019年第18期17卷 6020-6027页

作者：韩玉乾许金鸽于放王燕燕大连工业大学生物工程学院

喜树碱(Campothecin)为单萜吲哚生物碱,是唯一通过抑制拓扑异构酶Ⅰ发挥细胞毒性的天然植物活性成分,具有优良的抗癌活性。但是喜树碱在植物中积累量极低,无法广泛应用于临床。经长期研究发现,运用基因工程方法提高药用植物细胞药用活... 详细信息

喜树碱(Campothecin)为单萜吲哚生物碱,是唯一通过抑制拓扑异构酶Ⅰ发挥细胞毒性的天然植物活性成分,具有优良的抗癌活性。但是喜树碱在植物中积累量极低,无法广泛应用于临床。经长期研究发现,运用基因工程方法提高药用植物细胞药用活性成分含量具有潜在的市场价值。本综述详细阐述了多种调控喜树碱合成的因子(如真菌诱导子或抗褐变剂,环境因子,生物碱前体物质,转录因子,外源激素,金属离子等)以及相关调控喜树碱合成的机制,其中以转录因子和关键酶基因过表达促进喜树碱的合成效果更为明显。这两种方法在源头上解决了喜树碱供应不足的问题,为深入研究喜树碱生物合成调控提供理论依据。

关键词：喜树碱生物合成调控转录因子关键酶基因诱导子

基于阳春砂HMGR和DXR基因的萜类化合物生物合成调控研究

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基于阳春砂HMGR和DXR基因的萜类化合物生物合成调控研究

作者：魏洁书广州中医药大学

学位级别：硕士

姜科Zingiberaceae豆蔻属植物阳春砂Amomum villosum Lour.是我国著名的“四大南药”之一砂仁的主流品种。砂仁芳香化湿、行气止痛的主要药效物质为挥发油,其主要成分为单萜化合物。植物萜类化合物的生物合成至少有2条途径。一条... 详细信息

姜科Zingiberaceae豆蔻属植物阳春砂Amomum villosum Lour.是我国著名的“四大南药”之一砂仁的主流品种。砂仁芳香化湿、行气止痛的主要药效物质为挥发油,其主要成分为单萜化合物。植物萜类化合物的生物合成至少有2条途径。一条是细胞质中的甲羟戊酸途径（mevalonate pathway, MVA途径）,另一条是质体中的2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸途径（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway, MEP途径）。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR）和1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase, DXR）分别是MVA和MEP上游途径中的2个关键酶。 1目的通过对阳春砂萜类化合物生物合成途径的关键酶基因AvHMGR和AνDXR在模式植物烟草中共同和单独过量表达、对烟草施用专一抑制剂以及利用茉莉酸甲酯对阳春砂的诱导,分析萜类合成途径相关基因的表达及相互作用,探讨AvHMGR和AvDXR对不同萜类化合物合成的调控差异,论证HMGR和DXR在萜类化合物合成过程中的关键作用以及2条途径间的协同作用。 2方法 2.1获得AνHMGR和AνDXR基因单独及共同超表达植株对AνHMGR和AνDXR基因单独转化烟草T2代及用农杆菌介导法构建的AvHMGR和AvDXR双基因转化烟草T1代,进行抗生素及PCR筛选。荧光定量PCR法测定外源基因AvHMGR和AνDXR、内源基因NtHMGR和NtDXR及下游基因法尼基焦磷酸合成酶基因（FPPS）和香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因（GGPPS）表达量。专一底物法检测AvHMGR和AvDXR基因分别和共同过量表达的烟草中HMGR和DXR酶活性。 2.2获得HMGR、DXR受抑制的野生型烟草植株对野生型烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂MEV（洛伐他丁）和FSM（膦胺霉素）,荧光定量PCR法测定内源基因***及下游基因FPPS、GGPPS表达量变化。专一底物法测定施用抑制剂后烟草HMGR及DXR酶活性变化。 2.3MVA和MEP途径被促进或抑制后不同萜类化合物的分析用石油醚提取烟草挥发性萜类,二氯甲烷超声法提取植物甾醇,气相色谱质谱法（GC-MS）进行分析,用丙酮法提取萜类光合色素,分光光度法进行分析。 2.4茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate, MeJA）对阳春砂萜类化合物的调控利用不同浓度茉莉酸甲酯喷施阳春砂叶片,荧光定量PCR法测定阳春砂AvHMGR和AvDXR基因表达量变化,用石油醚提取阳春砂叶片的挥发性萜类,GC-MS法分析含量变化。 2.5综合分析结合单基因、双基因超表达烟草、抑制剂处理烟草及茉莉酸甲酯处理阳春砂结果,分析MVA和／或MEP途径被促进或抑制后对不同萜类化合物代谢的影响。 3结果 3.1获得AvHMGR和AvDXR基因单独及共同超表达植株 AvHMGR和AvDXR转基因烟草T2代、双基因转化烟草T1代中外源基因获得超表达,大部分烟草内源基因及下游基因表达量有所提高。AvHMGR和AvDXR单独超表达烟草T2代HMGR和DXR活性显著降低,部分共同超表达烟草HMGR、DXR活性显著提高。 3.2获得HMGR,DXR受抑制的野生型烟草植株抑制剂处理后烟草内源基因NtHMGR和NtDXR表达量在24h受到明显抑制,HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制,获得HMGR和DXR受抑制的烟草植株。 3.3AvHMGR和AvDXR基因单独及共同超表达对烟草萜类化合物生物合成的影响 AvHMGR和AvDXR在烟草中的单独超表达促进了单萜类化合物p-蒎烯,萜类化合物五针松烯、新植二烯、黑松醇、植醇、维生素E及三萜化合物甾醇（包括β-谷甾醇,豆甾醇,菜油甾醇）的合成,降低了单萜薄荷烯、萜类光合色素的含量,AvHMGR和AνDXR的共同超表达促进了部分植株类胡萝卜素合成,降低了部分植株叶绿素的含量。 3.4抑制剂对野生型烟草萜类化合物生物合成及转基因烟草表型的影响野生型烟草喷施HMGR或DXR的专一抑制剂MEV或FSM后,三萜化合物甾醇、单萜类化合物β-蒎烯和二萜类化合物新植二烯、黑松醇、植醇及维生素E的合成受到抑制。AvHMGR和AvDXR在烟草中的超表达可以抵抗MEV和FSM分别对烟草造成的皱缩及白化现象。

关键词：阳春砂 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR) 1-去氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR) 萜类化合物专一抑制剂茉莉酸甲酯生物合成调控

产N6-（2-羟乙基）腺苷（HEA）的虫草菌资源及HEA生物合成调控研究

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产N6-（2-羟乙基）腺苷（HEA）的虫草菌资源及HEA生物合成调控研究

作者：刘宽博贵州大学

学位级别：硕士

N6-(2-羟乙基)腺苷[N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine,HEA]属腺苷衍生物,具有多种药理功效,是第一个生物来源的钙离子拮抗剂。HEA集医药保健、化妆品和生物防治多项开发潜力于一身,有着良好的临床应用前景。但是目前已知的产HEA资源极其有... 详细信息

N6-(2-羟乙基)腺苷[N6-(2-hydroxyethyl)-adenosine,HEA]属腺苷衍生物,具有多种药理功效,是第一个生物来源的钙离子拮抗剂。HEA集医药保健、化妆品和生物防治多项开发潜力于一身,有着良好的临床应用前景。但是目前已知的产HEA资源极其有限,产生HEA的资源亟待挖掘,因此对HEA生物合成调控进行研究,为HEA的深入研究和开发应用提供指导。本研究选择实验室26株(涉及17个种)广义虫草属菌株进行液体培养、子实体栽培,HPLC检测其HEA产生并经质谱鉴定。结果发现除已报道产HEA的虫草菌外,发现6种新的HEA产生菌:包括球孢白僵菌[Beauveria bassiana(Bals.-Criv.)Vuill.]、布氏白僵菌[Beauveria brongniartii(Sacc.)Petch]、广东虫草(Cordyceps guangdongensis ***,***&***)、Lecanicillium psalliotae(Treschew)Zare&***、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali ***&*** ex ***)、淡紫拟青霉[Paecilomyces lilacinus(Thom)Samson]。球孢白僵菌液体培养动力学研究发现第7 d HEA产量最大,达到0.848±0.044 mg/g。蝉花虫草具有相对较高的HEA含量,因此对其人工栽培的方法进行系统优化。结果发现:25°C、白光150 lux,脱壳小麦、葡萄糖和A-蛋白胨有利于HEA的产生。蝉花在35 d干重和HEA含量达到最大值而后降低。蝉花具有自发荧光现象,实验室所有菌株均为单一交配型MATing 1-2。农杆菌介导蝉花孢子转化构建突变体库,筛选到能高产HEA菌株。转化子验证成功33个,转化率16.37%,选择在平板上形态有明显差异的突变株进行栽培。检测发现Z4转化子是其中HEA含量最高的菌株,突变株可能出现生长不健全现象。蝉花孢子粉和孢梗束价格差异巨大,甲醇粗提物分析了两者的差异,并探究硅胶柱层析法和高效液相色谱制备法分离两者有差异的化合物。

关键词： N6-(2-羟乙基)腺苷虫草菌资源蝉花生物合成调控

浙江大学揭示SlIAA23-SlARF6模块通过调控独脚金内酯的生物合成调控番茄丛枝菌根共生

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蔬菜 2023年第4期 83-83页

大多数陆地植物能够与丛枝菌根真菌(AMF)建立共生关系,以提高其对土壤养分的吸收和获取能力,尤其是磷(P)。植物与丛枝菌根共生是一个精细且复杂的调控过程,其中植物激素在菌根共生的建立和维持方面发挥重要作用,但具体分子机制并不清楚。

关键词：丛枝菌根生物合成调控共生关系植物激素陆地植物独脚金内酯调控过程菌根共生

SmWRKY20转录因子调控丹参有效成分生物合成的研究

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SmWRKY20转录因子调控丹参有效成分生物合成的研究

作者：王世威广东药科大学

学位级别：硕士

丹参作为传承千年的中药,具有活血化瘀、通经止痛等功效,为历代中医药人认可。现代药理研究发现,丹参在治疗心脑血管疾病方面发挥重要作用,并且还能辅助抗肿瘤和肝脏纤维化等,成为中药走向国际的先行者。近年来,随着药用植物基因组学、... 详细信息

丹参作为传承千年的中药,具有活血化瘀、通经止痛等功效,为历代中医药人认可。现代药理研究发现,丹参在治疗心脑血管疾病方面发挥重要作用,并且还能辅助抗肿瘤和肝脏纤维化等,成为中药走向国际的先行者。近年来,随着药用植物基因组学、转录组学、代谢组学和蛋白组学等组学技术的发展,丹参药用活性成分丹参酮和丹酚酸生物合成途径中的酶的功能不断被鉴定,尤其是丹参酮生物合成途径的解析获得了巨大的突破。转录因子是植物体内信号传导途径中最基本、最重要的调控方式,其中,WRKY、AP2/ERF、MYB和b HLH等转录因子在植物次生代谢生物合成途径的调控网络起到重要的作用。WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,它因含有一段保守的WRKYGQK基序而得名,能识别靶基因启动子中特异的核苷酸序列W-box（T/TGACCA/T）,参与植物的生长、发育、响应生物胁迫、非生物胁迫和植物次生代谢生物合成等过程。研究表明,WRKY转录因子参与了青蒿中青蒿素、长春花中长春花碱和丹参中丹参酮等药用活性成分生物合成途径的调控。本研究通过实验室最新研究结果-丹参基因组数据结合酵母提取物（YE）和银离子（Ag）共同诱导丹参毛状根的转录组数据,分别以丹参酮生物合成途径和丹酚酸生物途径关键基因为诱饵,进行共表达分析,结果推测WRKY转录因子SMILT032209可能参与调控了丹参酮和丹酚酸生物合成的调控。我们利用RT-PCR克隆技术,获得该基因的开放阅读框（ORF）序列。在NCBI数据库中进行BLAST,发现该基因与已注册的丹参转录因子Sm WRKY20同源性极高（99.49%）,因此将该基因命名为Sm WRKY20。首先对该基因进行生物信息学分析,结果表明,Sm WRKY20的ORF长987 bp,编码328个氨基酸,分子量为35.59 k Da,具有WRKYGQK保守基序和CH(C-X-C-X-HXH)型锌指结构组成的保守结构域,属于WRKYⅡd亚家族;时空表达分析结果表明,Sm WRKY20基因在植物激素脱落酸（Abscisic Acid,ABA）诱导丹参毛状根36h时间点,表达量急剧上升,说明外源激素ABA能诱导Sm WRKY20的表达;Sm WRKY20主要在根中表达,是叶片的4倍,并且有显著组织特异性;构建Sm WRKY20-GFP融合表达载体,通过农杆菌GV3101介导侵染烟草叶片进行瞬时表达,利用双分子荧光共聚焦显微镜在细胞中观察Sm WRKY20融合绿色荧光蛋白（GFP）的位置,结果表明Sm WRKY20定位细胞核中,符合大多数转录因子的定位特性。构建原核表达载体p MAL-c2X-Sm WRKY20,转化至大肠杆菌表达菌株BL21感受态,经IPTG诱导,成功表达出MBP-Sm WRKY20重组蛋白。利用Gateway技术构建Sm WRKY20过表达载体p K7WG2D-Sm WRKY20和RNAi干扰表达载体p K7GWIWG2D-Sm WRKY20,转化农杆菌C58C1,利用叶盘法介导的植物转化方法,获得WRKY20过表达毛状根株系和wrky20-RNAi干扰毛状根株系;通过超高效液相色谱法测定丹酚酸B（Salvianolic Acid B）和总丹酚酸（Salvianolic acid）含量,过表达株系WRKY20丹酚酸B含量比野生型提高了13～40%,总丹酚酸含量提高了16～40%,RNAi干扰表达株系wrky20丹酚酸B相对野生型下降了15～40%,总丹酚酸含量下降8～37%,这初步说明Sm WRKY20对丹酚酸的生物合成起正向调控作用。通过酵母自激活和酵母单杂交实验,发现Sm WRKY20没有转录激活活性,但能通过W-box顺式元件与多数丹酚酸生物合成基因Sm PAL1、Sm C4H1、Sm4CL2、Sm TAT1、Sm RAS1的启动子相结合,这表明Sm WRKY20转录因子可能通过与上述5个基因启动子结合正向调控丹酚酸生物合成。综上所述,现有结果初步推测Sm WRKY20可能是通过Sm PAL1、Sm C4H1、Sm4CL2、Sm TAT1、Sm RAS1基因参与正向调控丹酚酸类化合物合成和积累,为阐明丹酚酸生物合成的分子机制奠定基础。

关键词：丹参转录因子 WRKY 丹酚酸生物合成调控

SmAP2/ERF82调控丹参酮生物合成及丹参生长发育的功能研究

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SmAP2/ERF82调控丹参酮生物合成及丹参生长发育的功能研究

作者：张建红北京协和医学院

学位级别：硕士

丹参作为传统中草药,其活性成分丹参酮类化合物在治疗心脑血管等疾病方面均有显著活性。因此,丹参酮类化合物生物合成及调控研究一直是研究的热点。本研究基于实验室前期筛选丹参转录组数据获得一个在丹参根部特异性高表达的转录因子SmA... 详细信息

丹参作为传统中草药,其活性成分丹参酮类化合物在治疗心脑血管等疾病方面均有显著活性。因此,丹参酮类化合物生物合成及调控研究一直是研究的热点。本研究基于实验室前期筛选丹参转录组数据获得一个在丹参根部特异性高表达的转录因子SmAP2/ERF82。在本研究中,利用实时荧光定量PCR方法验证了SmAP2/ERF82在丹参根和根韧皮部表达量极高。蛋白亚细胞定位实验表明SmAP2/ERF82定位于细胞核。转录因子自激活活性实验表明SmAP2/ERF82不具有自激活活性。本研究通过构建SmAP2/ERF82的RNAi和过表达重组质粒,转化发根农杆菌ACCC10060,侵染丹参叶片,获得了丹参转基因毛状根。通过检测转基因毛状根中SmAP2/ERF82基因抑制和过表达效率,筛选出三个RNAi株系(82i-1/5/9)和三个过表达株系(82oe-3/5/7)。UPLC检测了转基因毛状根中丹参酮类化合物和RNAi株系中丹酚酸类化合物的含量,结果表明:与对照株系相比,在RNAi株系中,二氢丹参酮I和丹参酮I的含量降低,而在过表达株系中,二者的含量显著升高,表明SmAP2/ERF82具有正向调控丹参酮生物合成的作用;而丹酚酸类化合物在RNAi株系中无明显变化,表明SmAP2/ERF82对丹酚酸合成和代谢不具调控作用。为进一步解析SmAP2/ERF82参与丹参酮类化合物合成的调控机制,通过实时荧光定量PCR分析转基因毛状根中丹参酮生物合成途径关键酶基因表达量的变化。与对照株系相比,SmAP2/ERF82-RNAi株系中柯巴基焦磷酸合酶1(Copalyl diphosphate synthase l,CPS1)和细胞色素P450 CYP76AH3的表达量均显著下降,而SmAP2/ERF82-oe(过表达)株系中(除了 82oe-7),异戊烯基焦磷酸异构酶(Isopentenyl pyrophosphate isomerase,IDI1)和 CPS1关键酶基因的表达量上升。通过酵母单杂交实验发现SmAP2/ERF82与IDI1、CPS1和CYP76AH3这三个关键酶基因的启动子区结合,说明丹参SmAP2/ERF82转录因子可能通过调控丹参酮生物合成途径关键酶基因的表达调节丹参酮的生物合成。本研究将SmAP2/ERF82-RNAi和SmAP2/ERF82-oe过表达重组质粒,转化根癌农杆菌EH105,侵染丹参叶片,获得丹参转基因组培苗,共获得一个RNAi株系(82i-6)和三个过表达株系(82oe-1/15/16)。观察发现:与对照株系(pki)相比,RNAi株系生长正常,且根系较发达;而与对照株系(pkoe)相比,过表达株系生长矮小,叶片小而皱缩,根系较稀疏。表明SmAP2/ERF82可能参与调控丹参株形发育。为进一步验证SmAP2/ERF82在植物生长发育中的功能,将SmAP2/ERF82过表达重组质粒转化根癌农杆菌GV3101,通过花芽浸蘸法获得了过表达SmAP2/ERF82的拟南芥。观察发现,对照株系生长正常,而过表达株系生长矮小,较少抽薹,说明在拟南芥中过表达SmAP2/ERF82基因影响了拟南芥的抽薹过程,进而影响了拟南芥的生长发育。将SmAP2/ERF82转基因毛状根分化获得的丹参苗进行RNA-Seq测序,分析转基因株系与对照株系的差异基因情况,结果发现:在RNAi株系中,赤霉素合成途径的关键酶基因GA 20-氧化酶(Gibberellin 20-oxidase,GA20ox)和GA 3-氧化酶(Gibberellin 3-oxidase,GA3ox)的表达量上调,在过表达株系中,关键酶基因GA20ox 和 GA 2-氧化酶(Gibberellin 2-oxidase,GA2ox)表达量下调。推测SmAP2/ERF82可能负调控赤霉素的生物合成。以上结果表明SmAP2/ERF82通过调控丹参酮生物合成途径中关键酶基因IDI1、CPS1和CYP76AH3的表达正调控丹参酮类化合物的生物合成;同时,还可能通过负调控赤霉素的生物合成来调控植物的生长发育过程。本研究通过鉴定SmAP2/ERF82转录因子的功能,表明该基因可能作为一个关键调节因子,调控丹参中以GGPP为共同底物的丹参酮和赤霉素这两类二萜类化合物的竞争性生物合成途径,发挥其在调控丹参酮生物合成和调节丹参生长发育过程中的重要作用,对进一步解析丹参活性成分的合成与调控机制具有重要意义。

关键词：丹参 SmAP2/ERF82 丹参酮生物合成调控生长发育调节

链霉菌抗生素生物合成基因簇中调控基因作用机制的初步研究

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链霉菌抗生素生物合成基因簇中调控基因作用机制的初步研究

作者：黄璐瑶华中师范大学

学位级别：硕士

模式菌株天蓝色链霉菌产生的放线紫红素是具有抗菌活性的芳香聚酮类抗生素。其生物合成基因簇中的actⅥ-ORFA可能与放线紫红素生物合成的调控有关。另一株链霉菌AM7161积累的美达霉素生物合成基因簇中也有一个同源基因med-ORF10功能与... 详细信息

模式菌株天蓝色链霉菌产生的放线紫红素是具有抗菌活性的芳香聚酮类抗生素。其生物合成基因簇中的actⅥ-ORFA可能与放线紫红素生物合成的调控有关。另一株链霉菌AM7161积累的美达霉素生物合成基因簇中也有一个同源基因med-ORF10功能与之相似,参与美达霉素的生物合成调控。本研究以调控基因actⅥ-ORFA和med-ORF10为研究对象,利用分子生物学和分析化学等多种手段,对actⅥ-ORFA和med-ORF10的调控机制展开初步研究,具体内容如下： (1) ActVI-ORFA蛋白的抗体制备及胞内表达检测为了研究actⅥ-ORFA在野生菌中的表达情况以及可能的调控机制,首先利用pET载体建立了actⅥ-ORFA的原核表达系统,在优化诱导表达条件的基础上获得了可溶性目的蛋白,制备了相应的多抗血清;然后利用多抗血清对放线紫红素产生菌中的目的基因的表达情况进行了检测,表明它在产生菌的稳定期大量表达,同时伴随放线紫红素的大量积累;在该基因缺失突变菌中,该蛋白表达缺失,放线紫红素产量急剧降低。这些结果从翻译水平上说明基因actⅥ-ORFA参与次生代谢,与放线紫红素生物合成有一定相关性,但调控机制有待进一步揭示。 (2) ActⅥ-ORFA蛋白的调控机制初步研究前期研究发现ActⅥ-ORFA在放线紫红素生物合成中起调控作用,从转录水平上调控同一基因簇几个基因的转录,且主要调控靶点是actⅥ-ORF1(编码立体专一性酮基还原酶,控制C3位置的手性结构的形成),但调控机制一直未有研究。我们首先通过凝胶迁移实验(EMSA)检测.ActⅥ-ORFA蛋白是否与actⅥ-ORF1的启动子区域直接结合发挥其调控作用：将靶基因actⅥ-ORF1的启动子片段(PactⅥ-ORF1)进行生物素标记,纯化透析的ActVI-ORFA蛋白与标记了的PactⅥ-ORF1共孵育,反应后体系进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜经X光曝光显影,在目前条件下ActⅥ-ORFA蛋白与PactⅥ-ORF1无明显结合现象,推测二者可能无直接结合作用,或二者即便有直接结合作用,但结合的条件较为苛刻。我们利用Pull down实验探究可能与之作用的蛋白：鉴于目的蛋白序列内部没有明显的DNA结合结构域,EMSA实验也未发现与靶DNA有结合能力,初步判断ActⅥ-ORFA蛋白可能不是通过与靶启动子结合行使调控作用,很可能是与天蓝色链霉菌里的某种蛋白直接结合来调控放线紫红素的合成。接下来,我们将经纯化、透析、浓缩后的ActⅥ-ORFA蛋白加入到actⅥ-ORFA缺失菌株Ⅵ-A/8600全蛋白中孵育,收集洗脱液,SDS-PAGE电泳检测,发现目的蛋白发生特异位点剪切,蛋白变小。进一步进行肽质谱分析,发现ActVI-ORFA的N端发生若干个氨基酸的缺失。这种蛋白酶活性有可能来自反应系统中其他蛋白,不排除是来自于目的蛋白的自我切割。 (3) Med-ORF10蛋白的抗体特异性改进前期实验利用Med-ORF10蛋白制备的多克隆抗体(鼠、兔两种来源)检测链霉菌中目的蛋白表达,发现检测出的目的蛋白分子量加倍。本实验对med-ORF10基因进行了体外的串联体大片段克隆,原核表达、纯化,分别注射了新西兰大白兔,制备Med-ORF10二串联体蛋白和三串联体蛋白的多克隆抗体。然而当使用制备的两种抗体检测链霉菌体内目的基因的表达情况时,在野生菌链霉菌AM7161、AM7161/pHSL98(过量表达Med-ORF10蛋白的菌株)和CH999/PIK340(全基因簇异源表达菌株)均无法检测到目标大小16KDa的阳性条带,在其约两倍大小32KDa处检测到明显条带,初步推测目的蛋白的翻译后修饰问题：在链霉菌中可能存在蛋白产物的某种类型的修饰,导致分子量变成其二倍大小。

关键词：链霉菌放线紫红素美达美素次生代谢生物合成调控

草酸青霉翻译延伸因子eEF1A在调控生物质降解酶合成中的功能鉴定

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草酸青霉翻译延伸因子eEF1A在调控生物质降解酶合成中的功能鉴定

作者：麦容铭广西大学

学位级别：硕士

植物生物质包括纤维素、半纤维素、淀粉等,是地球上最丰富的可再生生物质资源,是生物炼制生产清洁的可再生能源的原料。植物生物质的酶解是生物炼制的关键步骤。丝状真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）能分泌完整的植物生物质降解酶... 详细信息

植物生物质包括纤维素、半纤维素、淀粉等,是地球上最丰富的可再生生物质资源,是生物炼制生产清洁的可再生能源的原料。植物生物质的酶解是生物炼制的关键步骤。丝状真菌草酸青霉（Penicillium oxalicum）能分泌完整的植物生物质降解酶系,但存在产酶量不足、成本高等问题,对草酸青霉植物生物质降解酶的生物合成调控机理认识有限。本实验室前期研究发现了一个负向调控草酸青霉植物生物质降解酶生物合成的新转录因子PoxCxrC,但是其分子调控机理不清楚。本研究的目的是寻找与PoxCxrC相互作用的蛋白并鉴定其在植物生物质降解酶生物合成中的功能。本研究通过串联亲和层析纯化-质谱（TAP-MS）和免疫沉淀-质谱（IP-MS）筛选得到与PoxCxrC相互作用的候选蛋白26个。进一步通过GST pulldown验证发现2个蛋白POX00101和POX06702能和PoxCxrC结合。序列分析表明POX00101与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）菌株bd-A中GTP结合蛋白Ran的一致性为94.17%;POX06702与黑曲霉（Aspergillus niger）菌株CBS 101883中延伸因子EF-1α的一致性为94.98%,说明POX00101和POX06702分别是小GTPase Ran和翻译延伸因子eEF1A。以草酸青霉突变株ΔPox Ku70为出发菌株,通过同源重组法构建了基因eEF1A的过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A。与出发菌株ΔPox Ku70相比,过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A分别转接至Avicel和可溶性玉米淀粉培养基中培养2-4天,纤维素酶包括滤纸酶（Filter paper cellulase,FPase）、羧甲基纤维素酶（Carboxymethyl cellulase,CMCase）和β-葡萄糖苷酶（p-nitrophenyl-β-glucopyranosidase,p NPGase）产量显著提高31.03%-58.64%,木聚糖酶产量显著提高30.49%-40.61%,淀粉酶产量显著提高68.84%-100.48%,表明eEF1A过量表达能提高草酸青霉植物生物质降解酶的产量。构建草酸青霉突变体ΔPoxCxrC中过量表达eEF1A的菌株ΔPoxCxrC::eEF1A和在ΔPox Ku70中同时过量表达PoxCxrC和eEF1A的菌株ΔPox Ku70::PoxCxrC::eEF1A。在Avicel、麦麸加稻杆和可溶性玉米淀粉作为碳源诱导条件下,与突变体ΔPoxCxrC相比,草酸青霉工程菌株ΔPoxCxrC::eEF1A的纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶产量分别提高50.40%-98.43%、45.60%-120.76%和55.4%-314.6%。以上证明,敲除PoxCxrC同时过表达eEF1A提高草酸青霉植物生物质降解酶的产量是一条可行的策略。相比之下,与ΔPox Ku70::PoxCxrC相比,双基因过表达菌株ΔPox Ku70::PoxCxrC::eEF1A的纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶产量无显著变化,表明提高植物生物质降解酶基因m RNA水平是提高酶产量的前提条件。蛋白质的亚细胞定位研究发现,草酸青霉过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A-gfp中重组蛋白eEF1A-GFP主要定位在细胞质及细胞核周边。双基因过表达菌株ΔPox Ku70::PoxCxrC-gfp::eEF1A中重组蛋白PoxCxrC-GFP仍定位在细胞核。表型观察、孢子计数和生物量分析发现,在PDA固体培养基上,工程菌株ΔPoxCxrC::eEF1A的菌落直径明显比突变体ΔPoxCxrC大,但与出发菌株ΔPox Ku70相比无显著差别。在PDA、Avicel、麦麸加稻杆和可溶性玉米淀粉固体培养基上,过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A的孢子产量与出发菌株ΔPox Ku70相比显著增加19.3%-270.0%。在葡萄糖条件培养12 h-48 h,与出发菌株ΔPox Ku70相比,过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A、突变体ΔPoxCxrC和工程菌株ΔPoxCxrC::eEF1A的生物量无显著变化,但培养后期（60 h-72 h）生物量显著上升20.6%-30.4%。综上所述,eEF1A参与草酸青霉的生长和孢子产生。荧光定量PCR分析发现,过表达菌株ΔPox Ku70::eEF1A和工程菌株ΔPoxCxrC::eEF1A中,关键植物生物质降解酶基因和孢子产生相关调控基因的表达量显著变化,其中纤维素酶和木聚糖酶基因如cbh1、eg1、Cel12A和bgl1显著上调1.0-33.0倍,淀粉酶基因Po GA15A、POX02412、amy13A及其调控基因amy R上调3.9-62.2倍;孢子产生相关调控基因如

关键词：草酸青霉 PoxCxrC eEF1A 植物生物质降解酶生物合成调控