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甜菜黄素在解淀粉芽胞杆菌中的生物合成研究

甜菜黄素在解淀粉芽胞杆菌中的生物合成研究

作者：洪晨璐华中农业大学

学位级别：硕士

甜菜黄素是一种水溶性的天然植物色素,具有安全性高、色泽鲜艳、着色均匀和抗氧化性强等优点,在食品、医药和化妆品等领域具有广泛的应用价值。微生物具有生长繁殖快、易培养、操作简便等优点,利用微生物合成植物天然产物已成为近年来... 详细信息

甜菜黄素是一种水溶性的天然植物色素,具有安全性高、色泽鲜艳、着色均匀和抗氧化性强等优点,在食品、医药和化妆品等领域具有广泛的应用价值。微生物具有生长繁殖快、易培养、操作简便等优点,利用微生物合成植物天然产物已成为近年来的研究热点。本研究首次探索了甜菜黄素在原核微生物中的生物合成,通过大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统证实了原核微生物合成甜菜黄素的可行性,进而通过代谢工程手段探究了解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)合成甜菜黄素前体物酪氨酸的能力,在此基础上实现了甜菜黄素在***的生物合成,具体结果如下:因***具有遗传背景清晰、转化效率高、酪氨酸合成能力强等优点,本研究首先在***中探究了原核微生物合成甜菜黄素的可行性。以*** MG1655为出发菌株,重组表达具有酪氨酸羟化酶活性的羟化酶基因(hpa BC),典型黑色素的形成和SDS-PAGE分析证实了酪氨酸羟化酶的表达活性;进一步串联表达hpa BC和紫茉莉的4,5-多巴双加氧酶基因(DOD),获得工程菌MG1655/p Trc99a-hpa BC-DOD,成功实现了甜菜黄素的合成;并对比分析了不同宿主菌株MG1655、DH5α和BL21合成甜菜黄素的能力,进一步证实了原核微生物合成甜菜黄素的可行性,甜菜黄素的产量以抗坏血酸当量AAE表示,其中MG1655/p Trc99a-hpa BC-DOD的甜菜黄素发酵产量达2.38 mmol AAE/L;最后,将该菌株在四环素压力下连续传代培养60天120批次,进行实验室适应性进化,以黄色为高通量颜色筛选标记,获得了甜菜黄素产量显著提高的菌株,产量最高达3.92 mmol AAE/L,质粒拷贝数的提高是其产量提高的主要原因。酪氨酸是甜菜黄素合成的前体物,为提供充足的酪氨酸用于甜菜黄素合成,本研究通过代谢工程手段探究了***合成酪氨酸的能力。以*** HZ-12为出发菌株,解析了酪氨酸代谢相关基因对酪氨酸合成的影响,包括糖转运关键基因(pts G和glc P)、中心碳代谢途径关键基因(丙酮酸激酶基因pyk、转酮醇酶基因tkt A和PEP羧激酶基因pck A)、酪氨酸合成途径基因(预苯酸脱氢酶基因tyr A、天冬氨酸氨基转移酶基因yhd R和asp B)和酪氨酸分支降解途径基因(预苯酸脱水酶基因phe A)。其中,缺失pts G基因可显著提高酪氨酸的产量,达157.37 mg/L,比对照菌株HZ-12提高了20%,以蔗糖为发酵碳源时,酪氨酸产量达到397.04 mg/L。为了实现甜菜黄素在***中的合成,在HZ-12Δpts G的基础上分别游离表达了羟化酶基因(hpa BC)和4,5-多巴双加氧酶基因(DOD),获得工程菌HZ-12Δpts G/p STOP1622-hpa BC和HZ-12Δpts G/p HY-DOD,分别具有酪氨酸羟化酶活性和多巴双加氧酶活性。通过共培养工程菌HZ-12Δpts G/p STOP1622-hpa BC和HZ-12Δpts G/p HY-DOD,实现了甜菜黄素在芽胞杆菌中的合成。在共培养实验中进行补料操作,最大的甜菜黄素产量达3.06mmol AAE/L。为降低发酵过程中的支链短链脂肪酸异味物质,通过转录分析确定了潜在关键基因磷酸丁酰转移酶基因(ptb),构建了缺失ptb基因的工程菌HZ-12Δpts GΔptb/p STOP1622-hpa BC和HZ-12Δpts GΔptb/p HY-DOD,共培养发酵甜菜黄素的过程中,甜菜黄素合成未发生显著性变化,支链短链脂肪酸产量降低了50%。本研究首次实现了甜菜黄素在原核微生物系统中的合成,为甜菜色素的微生物高效合成奠定了基础。

关键词：解淀粉芽胞杆菌甜菜黄素生物合成酪氨酸代谢工程

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红甜菜色素稳定性影响因素研究进展

食品与生物技术学报 2021年第7期40卷 19-29页

作者：王萍闫明哲东北林业大学林学院黑龙江哈尔滨150040 黑龙江省森林食品资源利用重点实验室黑龙江哈尔滨150040

红甜菜是一种营养价值较高的食用蔬菜,含有大量的红甜菜色素。红甜菜色素是一种水溶性、含氮的季胺型生物碱,核心结构为甜菜醛氨酸。红甜菜色素依据化学结构不同可分为两类:甜菜红素和甜菜黄素。红甜菜色素作为一种食用天然色素,已应用... 详细信息

红甜菜是一种营养价值较高的食用蔬菜,含有大量的红甜菜色素。红甜菜色素是一种水溶性、含氮的季胺型生物碱,核心结构为甜菜醛氨酸。红甜菜色素依据化学结构不同可分为两类:甜菜红素和甜菜黄素。红甜菜色素作为一种食用天然色素,已应用于多种食品,但由于稳定性较差,其在食品、营养保健品和化妆品等领域的潜在应用受到诸多限制。作者综述了红甜菜色素的组成及结构,详细阐述了pH值、光照、温度、氧气和降解酶对红甜菜色素质量分数和颜色的影响,同时阐明了甜菜红素受这些因素影响后在易降解位置发生脱糖基化、脱羧、脱氢、醛亚胺键水解和异构化等化学变化的途径及产物,为深入研究甜菜色素稳定性、扩大红甜菜及红甜菜色素的应用领域提供参考。

关键词：红甜菜甜菜红素甜菜黄素稳定性

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高通量筛选高产酪氨酸的酿酒酵母菌株

生物工程学报 2021年第9期37卷 3348-3360页

作者：刘堂浩李由然张梁丁重阳顾正华石贵阳徐沙江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

酪氨酸是重要的芳香族氨基酸,自身不仅具有重要的营养价值,也是合成香豆素类化合物和黄酮类化合物的重要前体。文中以实验室前期构建的一株解除了酪氨酸反馈抑制的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae LTH0(ARO4K229L,ARO7G141S,Δaro10,... 详细信息

酪氨酸是重要的芳香族氨基酸,自身不仅具有重要的营养价值,也是合成香豆素类化合物和黄酮类化合物的重要前体。文中以实验室前期构建的一株解除了酪氨酸反馈抑制的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae LTH0(ARO4K229L,ARO7G141S,Δaro10,Δzwf1,Δura3)为出发菌株,异源表达甜菜黄素合成基因DOD和CYP76AD1,使酿酒酵母产生黄色荧光。然后利用紫外诱变和常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变相结合的方法对上述菌株进行随机诱变,并通过流式细胞仪筛选荧光强度显著提高的突变株。其中突变株LTH2-5-DOD-CYP76AD1在激发波长485 nm、发射波长505 nm处荧光强度为(5 941±435) AU/OD,比诱变前提高了8.37倍。对诱变后荧光强度提高较多的14株突变株进行发酵生产酪氨酸,胞外酪氨酸产量最高为26.8 mg/L,比出发菌株提高了3.96倍。进一步异源表达约翰逊黄杆菌Flavobacterium johnsoniae来源的酪氨酸解氨酶Fj TAL,对香豆酸产量达到119.8 mg/L,比出发菌株LTH0-FjTAL提高了1.02倍。

关键词：酪氨酸对香豆酸甜菜黄素高通量筛选

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植物甜菜素研究进展

植物学通报 2006年第3期23卷 302-311页

作者：王长泉刘涛王宝山山东理工大学生命科学学院山东师范大学生命科学学院济南250014 山东师范大学生命科学学院

植物花色素的研究已经非常广泛和深入,但是甜菜素作为类似花色素的一种重要的植物次生代谢物质还不被人们所熟悉。为了增加人们对甜菜素的了解,本文结合国内外研究的最新进展,从种类与化学结构、提纯与鉴定、稳定性及影响因素、合成途... 详细信息

植物花色素的研究已经非常广泛和深入,但是甜菜素作为类似花色素的一种重要的植物次生代谢物质还不被人们所熟悉。为了增加人们对甜菜素的了解,本文结合国内外研究的最新进展,从种类与化学结构、提纯与鉴定、稳定性及影响因素、合成途径、生物功能和应用价值等方面对甜菜素进行了介绍,重点比较分析了甜菜素和花色素结构和合成途径的不同与联系,并对当前甜菜素研究的热点领域和亟待解决的问题进行了展望。

关键词：甜菜素甜菜红素甜菜黄素甜菜醛氨酸多巴花色素

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甜菜素的生物合成及其代谢调控进展

中国生物工程杂志 2018年第8期38卷 84-91页

作者：于思礼刘雪张昭宇於洪建赵广荣天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室天津300350 天津益倍生物科技集团天津300450

甜菜素是一种植物源的水溶性天然含氮色素,用于食品添加剂和化妆品等行业中。在植物中甜菜素和花青素色素互不共存,其代谢途径是重要的植物化学分类指标。甜菜素兼具抗氧化、抗肿瘤、抗疟、保肝等药理作用,其潜在的医疗保健价值以及其... 详细信息

甜菜素是一种植物源的水溶性天然含氮色素,用于食品添加剂和化妆品等行业中。在植物中甜菜素和花青素色素互不共存,其代谢途径是重要的植物化学分类指标。甜菜素兼具抗氧化、抗肿瘤、抗疟、保肝等药理作用,其潜在的医疗保健价值以及其代谢途径的独特性,促进了对甜菜素深入研究。综述了甜菜素合成途径中的关键酶和合成生物学策略生产甜菜素的国内外研究进展,为建立合成生物方法生产甜菜素提供参考。

关键词：甜菜素生物合成合成生物学代谢工程甜菜红苷甜菜黄素

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工程大肠杆菌合成甜菜素

工程大肠杆菌合成甜菜素

作者：于思礼天津大学

学位级别：硕士

甜菜素是一种植物源的天然含氮色素,易溶于水,常用于食品添加剂和化妆品等行业中。在植物中甜菜素和花青素色素互不共存,其代谢途径是重要的植物化学分类指标。甜菜素兼具抗肿瘤、抗氧化、抗疟疾、护肝等作用,其潜在的医疗保健价值促进... 详细信息

甜菜素是一种植物源的天然含氮色素,易溶于水,常用于食品添加剂和化妆品等行业中。在植物中甜菜素和花青素色素互不共存,其代谢途径是重要的植物化学分类指标。甜菜素兼具抗肿瘤、抗氧化、抗疟疾、护肝等作用,其潜在的医疗保健价值促进了对甜菜素深入研究。本文筛选了从L-多巴到甜菜素关键中间产物甜菜醛氨酸的合成基因BvDODA、MjDODA、YgiD,成功在工程大肠杆菌中实现了体内合成甜菜醛氨酸。引入细胞色素P450氧化还原酶和酪氨酸羟化酶基因CYP76AD1、BvCPR、HpaBC打通了从L-酪氨酸到甜菜醛氨酸的合成途径。对底物前体和还原剂的添加量进行研究,并通过调整IPTG诱导浓度和对发酵条件进行优化得到产甜菜醛氨酸的最适条件,为合成不同种类的甜菜素建立了基础。在甜菜醛氨酸生成量最大阶段添加不同氨基酸来研究不同种类甜菜黄素的生成效率,通过试验20种氨基酸发现仅仅12种氨基酸能够与甜菜醛氨酸结合生成相应的甜菜黄素,其中组氨酸-甜菜黄素的生成量占绝对优势,以此确定为最终目标产物。采用间接思路通过对较稳定的组氨酸盐酸盐定量来间接确定最终生成组氨酸-甜菜黄素的含量,当添加6mM L-多巴、1mM抗坏血酸和6mM组氨酸盐酸时,生成445.84mg/L组氨酸-甜菜黄素。

关键词： L-酪氨酸 L-多巴甜菜醛氨酸甜菜黄素

利用反向代谢工程调控酿酒酵母酪氨酸合成途径

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利用反向代谢工程调控酿酒酵母酪氨酸合成途径

作者：刘堂浩江南大学

学位级别：硕士

酪氨酸是一种重要的芳香族氨基酸,常用于食品与医药领域,其衍生物包括:各种黄酮、有机酸和生物碱等。酿酒酵母作为模式真核微生物,常用于各种生物产品的工业生产,但酿酒酵母不能高产氨基酸。酿酒酵母能够高效表达酪氨酸下游的甜菜黄素,... 详细信息

酪氨酸是一种重要的芳香族氨基酸,常用于食品与医药领域,其衍生物包括:各种黄酮、有机酸和生物碱等。酿酒酵母作为模式真核微生物,常用于各种生物产品的工业生产,但酿酒酵母不能高产氨基酸。酿酒酵母能够高效表达酪氨酸下游的甜菜黄素,甜菜黄素具有明显颜色,相比酪氨酸更容易检测。本研究利用具有黄色荧光的酪氨酸衍生物甜菜黄素作为筛选指标,诱变筛选得到一株酪氨酸合成能力提高的重组菌。摇瓶发酵测定其酪氨酸和酪氨酸衍生物对香豆酸的产量,并通过进一步加强前体供应,削弱旁路代谢途径等策略,提高了对香豆酸的产量。对高效积累对香豆酸的突变株进行比较基因组测序分析以及相关基因的定量PCR分析,初步挖掘了一些潜在调控对香豆酸合成的关键基因。本研究主要结果如下:(1)以酿酒酵母LTH0为出发菌株,异源表达开花植物中的甜菜黄素合成途径,表达后菌落色泽明显变黄,培养72 h相对黄色荧光强度为1203±45 AU·OD,通过紫外诱变、ARTP诱变以及复合诱变方法,多代富集高荧光突变株,最终9代复合诱变后得到突变株LTHCB具有33 811±873 AU·OD的荧光强度,达到对照LTH0的28倍,且多次传代无明显减少,从三种突变所得的突变子文库中选取26株高荧光突变株。(2)LTH0摇瓶发酵,胞外测得5.3 mg·L酪氨酸,而26株突变株中的19株酪氨酸产量提高,所有突变株最高在胞外积累34.8 mg·L酪氨酸,相比对照提高了5.56倍。整合表达约翰逊黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)来源的酪氨酸解氨酶Fj TAL后,对照菌株LTH0的重组菌发酵得到189.4 mg·L对香豆酸,突变株最高积累341.9 mg·L对香豆酸,产量比对照提高了81.0%。在此基础上,敲除PDC1、PDC6、TRP2和PHA2等旁路代谢基因优化对香豆酸的积累,发现敲除PDC1和PDC6无明显影响,敲除TRP2和PHA2对香豆酸产量分别提高10.6%和23.1%;敲除ARO3和RIC1增加莽草酸途径前体积累,对香豆酸产量分别提高20%和17.7%。摇瓶水平上优化发酵条件,以30 g·L葡萄糖、10 g·L蛋白胨和5 g·L酵母粉作为碳氮源,补加碳酸钠并控制初始p H为6的情况下,敲除ARO3和RIC1的重组菌LTHH0积累442.7 mg·L对香豆酸。(3)根据反向代谢工程的策略,将已得到的最佳对香豆酸生产重组菌LTHH0和出发菌株LTH0进行基因组重测序并比对,从突变位点中寻找潜在的调控位点,分析发现217个基因的上下游或外显子区域发生突变,GO富集分析与Pathway富集分析后选择22个相关基因进行荧光定量PCR分析,从其中转录水平明显改变的18个基因中根据基因功能选取VBA4、TKL2、GAL2、GPP1和ESBP6分别进行敲除或过表达,发现分别敲除VBA4、GAL2、GPP1、过表达TKL2以及过表达ESBP6分别使对香豆酸产量增加了9.4%、23.3%、15.2%、13.8%和20.1%。最终得到一株LTHHH11重组菌株,摇瓶发酵积累到582.78 mg·L对香豆酸,相比LTH0提高2.08倍。

关键词：酪氨酸对香豆酸甜菜黄素高通量筛选