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甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系的优化

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江西农业大学学报 2012年第4期34卷 712-717页

作者：沈万宽习平根姜子德广州甘蔗糖业研究所/广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室广东广州510316 华南农业大学植物病理系广东广州510642

以甘蔗鞭黑粉菌交配型分离物为试验材料,采用CTAB法提取基因组DNA,并对影响甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立起适合甘蔗鞭黑粉菌基因组DNA的ISSR-PCR反应体系。优化的反应体系为:在25μL体系中,rTa... 详细信息

以甘蔗鞭黑粉菌交配型分离物为试验材料,采用CTAB法提取基因组DNA,并对影响甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立起适合甘蔗鞭黑粉菌基因组DNA的ISSR-PCR反应体系。优化的反应体系为:在25μL体系中,rTaq DNA聚合酶1.5 U、Mg2+浓度为2.0 mmol/L、dNTP浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、DNA模板10～20 ng、10×PCR buffer 1μL、用重蒸水补足25μL。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌 ISSR 体系优化

甘蔗鞭黑粉菌cAMP/PKA信号通路几个关键基因的功能分析

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甘蔗鞭黑粉菌cAMP/PKA信号通路几个关键基因的功能分析

作者：梅丹华南农业大学

学位级别：硕士

甘蔗黑穗病是一种严重影响甘蔗产量和质量的世界性病害,其病原菌甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)为二态型真菌,即生活史存在单倍体酵母状细胞和双核菌丝体两种形态。野生型单倍体不致病,不同性系的单细胞通过有性配合产生双核菌... 详细信息

甘蔗黑穗病是一种严重影响甘蔗产量和质量的世界性病害,其病原菌甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)为二态型真菌,即生活史存在单倍体酵母状细胞和双核菌丝体两种形态。野生型单倍体不致病,不同性系的单细胞通过有性配合产生双核菌丝体才能侵染寄主,因此病原菌进行有性配合是侵染寄主的前提。本研究针对影响甘蔗鞭黑粉病菌有性配合的cAMP/PKA信号通路的几个关键基因的功能进行了探讨和分析。为了获得突变体进行下一步分析,研究首先建立了基于甘蔗鞭黑粉菌的PEG介导的原生质体转化体系,随后利用同源敲除的方法对cAMP/PKA信号通路中的关键基因SsUAC1、SsADR1、SsPDE1、SsPDE2以及下游的关键转录调控因子SsPRF1进行了敲除及相关分析,主要研究结果如下:1.以甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株WT17和WT18为出发菌株,探索了原生质体的制备、再生以及抗生素筛选等各种条件对转化效率的影响,建立一套基于甘蔗鞭黑粉菌的高效的PEG介导的原生质体转化体系(原生质体的制备率达60%,再生率达40%)。制备甘蔗鞭黑粉菌原生质体的最佳条件是:菌株活化24h后,1/100的接种量转接于60ml YePS液体培养基中继续培养7h,至OD为0.7,菌体用渗透溶液洗涤后,加入2ml 10mg/ml的酶制剂,于28℃处理30min。通过设置两种不同抗生素的浓度梯度,筛选出合适的抗生素为当潮霉素,其筛选终浓度为200?g/ml时,再生板上的转化子数量适宜,便于挑选。2.以甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株WT17为出发菌株,运用高效PEG介导的原生质体转化体系,通过同源敲除成功获得了基因SsUAC1、SsADR1、SsPDE1、SsPDE2和SsPRF1的敲除突变体ΔSsuac1、ΔSsadr1、ΔSspde1、ΔSspde2和ΔSsprf1。3.突变体表型分析发现,发现ΔSsuac1、ΔSsadr1和ΔSsprf1均为有性配合缺陷突变体,即ΔSsuac1和ΔSsadr1分别与野生型甘蔗鞭黑粉菌WT18配合,菌丝形成缓慢;ΔSsprf1与WT18配合则没有菌丝生长;而突变体ΔSspde1和ΔSspde2与野生型差异不明显。4.在YePS固体培养基上外源添加7.5mM cAMP时,突变体ΔSsuac1的有性配合能力得到恢复,长出白色菌丝;突变体ΔSsadr1的有性配合能力恢复较弱;而突变体ΔSspde1、ΔSspde2和ΔSsprf1的有性配合反而被抑制,表明基因SsUAC1通过正调控cAMP信号来调控甘蔗鞭黑粉菌有性配合过程。5.在YePS固体培养基上外源添加0.7mM HO时,野生型及突变体ΔSsuac1、ΔSsadr1、ΔSspde1、ΔSspde2和ΔSsprf1的生长受到抑制,其中ΔSsuac1和ΔSsadr1更明显,而同时添加7.5mM cAMP,各测试菌株的生长则基本恢复正常,表明cAMP参与胞内氧化应激的过程。6.在7.5mM及更高浓度的Zn离子的条件下,甘蔗鞭黑粉菌的有性配合能力受到明显抑制,如野生型和两个有性配合正常的突变体ΔSspde1和ΔSspde2的均不能形成白色菌丝体。相对于野生型,突变体ΔSsuac1、ΔSsadr1和ΔSspde2的单倍体生长对Zn更敏感,并且它们的表型都不能被外源添加的cAMP恢复,暗示这几个基因可能独立于cAMP途径抵抗高浓度Zn的毒性或参与Zn在细胞的生理功能。本研究首次建立了基于甘蔗鞭黑粉菌PEG介导的原生质体转化体系,成功获得cAMP/PKA信号通路几个关键基因的敲除突变体ΔSsuac1、ΔSsadr1、ΔSspde1、ΔSspde2、ΔSsprf1。通过对突变体的分析,发现基因SsUAC1通过正调控cAMP信号转导调控甘蔗鞭黑粉菌的有性配合,同时研究发现cAMP/PKA信号通路参与胞内氧化应激的过程,并在抵抗逆境过程中发挥着一定的功能。本研究的开展将为防控甘蔗黑穗病提供理论依据。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌有性配合 cAMP/PKA 抗逆胁迫

甘蔗鞭黑粉菌中膜泡蛋白SsDid4在有性配合与逆境胁迫中的作用研究

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甘蔗鞭黑粉菌中膜泡蛋白SsDid4在有性配合与逆境胁迫中的作用研究

作者：吴熔熔华南农业大学

学位级别：硕士

甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitaminea)是担子菌亚门孢堆黑粉菌属真菌,主要危害甘蔗。甘蔗鞭黑粉菌是二态型真菌,单倍体不致病,只有当两个不同性系的单倍体进行有性配合形成双核菌丝体时,才具有侵染宿主的能力。膜泡运输是细胞输送各类... 详细信息

甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitaminea)是担子菌亚门孢堆黑粉菌属真菌,主要危害甘蔗。甘蔗鞭黑粉菌是二态型真菌,单倍体不致病,只有当两个不同性系的单倍体进行有性配合形成双核菌丝体时,才具有侵染宿主的能力。膜泡运输是细胞输送各类营养物质以及信号转导的重要途径。本研究在甘蔗鞭黑粉菌中鉴定了一个参与膜泡形成的Ss DID4基因,分析了其在有性配合及抗逆胁迫中的重要作用,主要研究结果如下:(1)以甘蔗鞭黑粉菌野生型WT17为研究对象,利用PEG介导的原生质体转化,获得同源敲除突变体ssdid4Δ,并对其进行基因回补,获得回补突变体Ss DID4-COM。FM4-64染色结果显示,膜泡在突变体ssdid4Δ中的形成受阻,在互补体中得到恢复,表明Ss Did4是膜泡形成必需的。(2)对突变体进行有性配合的表型分析,发现ssdid4Δ与WT18混合后表现为弱配合,Ss DID4-COM有性配合完全恢复。外源添加人工合成的WT18的性信息素Mfa2,结果显示Mfa2能促进WT17和Ss DID4-COM单倍体产生菌丝,但对ssdid4Δ没有影响。外源添加5m M c AMP不能恢复ssdid4Δ的有性配合,荧光定量PCR结果显示ssdid4Δ中c AMP-PKA的Ss GPA3、Ss UAC1、Ss ADR1表达也没有受影响。检测MAPK通路的关键基因CRK1、FUZ7、KPP2、PRF1及其下游a,b位点的基因的表达量发现这些基因表达都显著下调。这些结果表明Ss DID4可能影响信息素信号的转运并通过MAPK通路调控甘蔗鞭黑粉菌的有性配合。(3)对突变体生长和显微形态进行观察发现,ssdid4Δ生长显著减慢,且单倍体菌体呈串连的类似假菌丝体的形态;细胞壁应激表型分析,显示ssdid4Δ对刚果红(1.0mg/m L)敏感,但对CFW(荧光增白剂,0.5 mg/m L)不敏感;对突变体进行二价离子耐受性检测,结果表明ssdid4Δ对Zn(5 m M)、Fe(7.5 m M)、Cu(7.5 m M)、Mn(5 m M)、Mg(800 m M)等二价金属离子的耐受性显著降低;此外,突变体ssdid4Δ对SDS(0.004%)、EGTA(2.5 m M)的耐受性也显著降低;荧光定量PCR检测β-葡聚糖合成相关基因,结果显示ssdid4Δ中参与合成β-葡聚糖的基因显著下调。以上结果表明Ss Did4在维持甘蔗鞭黑粉菌细胞壁完整性及胞内金属离子稳态中具有重要作用。(4)氧化应激反应结果显示,ssdid4Δ对HO的敏感性明显增强;细胞色素P450氧化酶基因在突变体ssdid4Δ的表达量均显著下调,表明基因Ss DID4可能通过影响细胞色素P450的表达,进而参与甘蔗鞭黑粉菌抗氧化胁迫的过程。本课题首次发现膜泡蛋白Ss Did4介导信息素的转运,且通过影响MAPK信号通路参与甘蔗鞭黑粉菌的有性配合,同时在细胞壁完整性、胞内金属离子稳态,以及在高渗透压力和氧化应激等多种逆境胁迫的应答过程中有着重要的作用。本课题的开展将为甘蔗鞭黑粉病的新型防控策略提供理论基础。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌有性配合膜泡运输基因SsDID4

甘蔗鞭黑粉菌致病力差异菌株转录组测序及候选基因SsCI68230功能分析

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甘蔗鞭黑粉菌致病力差异菌株转录组测序及候选基因SsCI68230功能...

作者：吴佳华南农业大学

学位级别：硕士

甘蔗黑穗病(Sugarcane smut)由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起,是甘蔗生产中一种世界性的气传真菌病害,严重影响甘蔗的产量和质量,对我国乃至世界的糖业生产均是个巨大的威胁。深入挖掘甘蔗鞭黑粉菌致病相关基因,对于揭示... 详细信息

甘蔗黑穗病(Sugarcane smut)由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起,是甘蔗生产中一种世界性的气传真菌病害,严重影响甘蔗的产量和质量,对我国乃至世界的糖业生产均是个巨大的威胁。深入挖掘甘蔗鞭黑粉菌致病相关基因,对于揭示甘蔗鞭黑粉菌致病机理、防治甘蔗黑穗病具有重要意义。本研究采用转录组测序技术比较分析了两个不同致病力甘蔗鞭黑粉菌菌株Ss16(强致病力)和Ss47(弱致病力)单倍体时的基因表达情况。通过差异基因表达分析、GO功能注释以及KEGG代谢通路富集分析等方法筛选相关致病基因。在此基础上,通过Split-marker基因敲除技术对候选致病相关基因SsCI68230进行初步功能分析。本研究的主要结果如下:1致病候选基因的筛选(1)基因差异表达分析及GO注释分类:比较分析两个不同致病力菌株Ss16和Ss47的转录组数据,以Padj甘蔗鞭黑粉菌非生物胁迫、细胞壁完整性、菌株生长等无影响,而与甘蔗鞭黑粉菌的有性配合及致病力有关,“+”“-”突变体间或突变体与野生型的有性配合能力及致病力均较其野生型明显减弱,外源添加cAMP或色醇等小分子信号物质可使突变体间或突变体与野生型配合能力得到恢复,表明ABC转运蛋白SsCI68230参与调控有性配合的cAMP或色醇等小分子信号物质转运。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌转录组分析 ABC转运蛋白色醇 cAMP

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甘蔗鞭黑粉菌拮抗菌筛选与抑菌物质活性测定

甘蔗鞭黑粉菌拮抗菌筛选与抑菌物质活性测定

作者：仇善旭华南农业大学

学位级别：硕士

甘蔗是世界上重要的糖料作物和具有很大发展潜力的生物质能源作物。由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitanminea)引起的甘蔗鞭黑穗病是严重影响甘蔗产量和质量的重要病害之一,给甘蔗产业造成巨大损失。甘蔗鞭黑粉菌侵入后在甘蔗体内生长,... 详细信息

甘蔗是世界上重要的糖料作物和具有很大发展潜力的生物质能源作物。由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitanminea)引起的甘蔗鞭黑穗病是严重影响甘蔗产量和质量的重要病害之一,给甘蔗产业造成巨大损失。甘蔗鞭黑粉菌侵入后在甘蔗体内生长,传统化学农药难于进入甘蔗体内,防治效果差,且对环境造成很大污染。为了开发甘蔗鞭黑穗病生防技术,本论文以抑制甘蔗鞭黑粉菌生长或有性配合为目标,自甘蔗根际土壤和甘蔗内生细菌各筛选获得1株效果明显拮抗菌株,对其活性物质进行了分离和鉴定;同时自生物源小分子库选出的14个筛选得到倍半萜类化合物法尼醇,并对该物质与3种内吸杀菌剂协同增效作用进行了测试。主要研究结果如下:通过稀释分离自甘蔗根际土壤分离细菌菌株150个,经4轮筛选获得了1株对甘蔗鞭黑粉菌有显著抑制作用的假单胞菌(***)菌株LC4-1;其发酵液的乙酸乙酯萃取粗提物能抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合及菌丝延伸,此外该菌株也产生具有挥发性抑菌活性的物质。对粗提物通过分离纯化,获得一个单一化合物,经核磁共振分析与质谱比对,鉴定为吩嗪-1-羧酸(CHNO),其在LB培养基28℃培养24小时条件下的产率为40mg/L。通过梯度分离培养从甘蔗茎秆内分离菌株80个,经3次筛选获得了1株对甘蔗鞭黑粉菌有显著抑制作用的芽孢杆菌(Bacillus)菌株A52-1;其发酵液的硫酸铵沉淀和乙酸乙酯萃取粗提物均抑制甘蔗鞭黑粉菌的生长和有性配合,其中萃取组分活性稳定。对萃取粗提物通过液相色谱仪分离纯化得到的单一产物,经质谱比对和核磁共振检测鉴定该物质参考分子式为CHN。通过对已知生物源小分子物质库选取的14个物质进行筛选,发现法尼醇对甘蔗鞭黑粉菌生活史不同阶段都具有明显抑制作用。在法尼醇0.5μM的处理中,冬孢子萌发率降低50%以上,担孢子存活率低于20%,;在0.04μM法尼醇的处理下可显著抑制甘蔗鞭黑粉菌的有性配合和减少菌丝的形成,显示出其具有开发成为甘蔗鞭黑粉菌新型杀菌剂的潜能。为此,将法尼醇与目前防治真菌病害常选用的3种内吸杀菌剂嘧菌酯、苯醚甲环唑、己唑醇进行协同增效测试,0.15μM的法尼醇与嘧菌酯混配的增效比达到34倍,与苯醚甲环唑混配增效比达到74倍,与己唑醇混配增效比达到59倍,显著提高杀菌剂的药效,从而达到同样抑菌效果下大大降低了杀菌剂的用量。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌甘蔗鞭黑穗病拮抗菌吩嗪-1-羧酸法尼醇

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甘蔗鞭黑粉菌外泌体的蛋白组学分析

甘蔗鞭黑粉菌外泌体的蛋白组学分析

作者：黄培珅华南农业大学

学位级别：硕士

甘蔗是我国重要的糖料作物,由甘蔗鞭黑粉菌引起的甘蔗鞭黑穗病是危害甘蔗产业最严重的病害之一。甘蔗鞭黑粉菌为二态型真菌,有性配合是甘蔗鞭黑粉菌具有侵染能力的重要过程,因此研究甘蔗黑粉菌的有性配合是防控甘蔗黑穗病的关键。外泌... 详细信息

甘蔗是我国重要的糖料作物,由甘蔗鞭黑粉菌引起的甘蔗鞭黑穗病是危害甘蔗产业最严重的病害之一。甘蔗鞭黑粉菌为二态型真菌,有性配合是甘蔗鞭黑粉菌具有侵染能力的重要过程,因此研究甘蔗黑粉菌的有性配合是防控甘蔗黑穗病的关键。外泌体是细胞分泌至胞外的携带多种生物活性分子的囊泡,参与多种大分子物质运输和生物过程。本研究以甘蔗鞭黑粉菌野生型单倍体为材料,通过分离纯化并鉴定了甘蔗鞭黑粉菌产生的外泌体,质谱分析鉴定了其中包含的蛋白组分,进一步研究确定了外泌体介导的SsRas1胞间运输参与有性配合及抗逆,主要研究结果如下:1.通过超速离心法对甘蔗鞭黑粉菌单倍体的外泌体进行分离纯化。通过透射电镜观察、粒径分析仪测定粒径分布,鉴定从甘蔗鞭黑粉菌野生型MAT-1单倍体分离得到的样品是外泌体。比较超速离心法、化学聚沉法和亲和柱法三种方法提取的外泌体结构与粒径分布,最终确定亲和柱法提取的外泌体纯度和提取效率优于另外两种方法。2.在YePS培养基和MM培养基培养条件下提取甘蔗鞭黑粉菌野生型MAT-1单倍体外泌体,对其中蛋白组分进行质谱鉴定,两种条件下在甘蔗鞭黑粉菌野生型MAT-1的外泌体中共鉴定到1250种蛋白,生物信息学比较分析显示,其中只有281个蛋白为两种培养条件下共有的,表明不同培养条件下的甘蔗鞭黑粉菌分泌的外泌体中的蛋白组分有明显差异。3.进一步对鉴定的外泌体蛋白进行分析比较发现小G蛋白Ras1在两种培养条件下均能检测到,表明甘蔗鞭黑粉菌Ras1是一种受培养条件影响较小能被外泌体稳定转运出细胞外的蛋白。用纯化获得的野生型MAT-1的外泌体和敲除突变体Ras1Δ外泌体分别处理SsRas1敲除突变体,结果发现经过野生型外泌体处理过的SsRas1敲除突变体的有性配合表型能部分恢复,同时对刚果红、SDS等胁迫因子的耐受能力也有所恢复,而经敲除突变体Ras1Δ的外泌体处理的SsRas1敲除突变体及空白对照组则不能,这表明外泌体介导的Ras1能够进行胞间通讯。4.通过蛋白免疫印痕实验检测SsRas1蛋白在C端CAAX基序修饰是否是包装进入外泌体所必须的,检测结果显示CAAX基序错误修饰的Ras1蛋白也能从外泌体中检测到,表明SsRas1蛋白的末端CAAX的法尼基修饰不影响SsRas1蛋白被包装进入外泌体。本研究首次在植物病原真菌甘蔗鞭黑粉菌中分离鉴定到外泌体,并进一步外泌体包含的蛋白组分中鉴定到小G蛋白SsRas1,发现SsRas1的胞间运输及通讯参与调控甘蔗鞭黑粉菌的有性配合和抗逆胁迫,本研究的开展将为甘蔗黑穗病的防控技术提供理论依据。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌外泌体小G蛋白SsRas1 有性配合抗逆胁迫

甘蔗鞭黑粉菌效应物蛋白基因pep1的功能研究

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甘蔗鞭黑粉菌效应物蛋白基因pep1的功能研究

作者：王雨坤广西大学

学位级别：硕士

甘蔗鞭黑粉菌是担子菌亚门孢堆黑粉菌属的一种二态型真菌,由其引发的甘蔗黑穗病是我国甘蔗生产上最为重要的病害,对我国甘蔗糖产业的发展影响极大。甘蔗鞭黑粉菌致病机理目前尚未完全明确,但有报道表明效应物蛋白可能在致病过程中起重... 详细信息

甘蔗鞭黑粉菌是担子菌亚门孢堆黑粉菌属的一种二态型真菌,由其引发的甘蔗黑穗病是我国甘蔗生产上最为重要的病害,对我国甘蔗糖产业的发展影响极大。甘蔗鞭黑粉菌致病机理目前尚未完全明确,但有报道表明效应物蛋白可能在致病过程中起重要作用。本研究在实验室前期敲除甘蔗鞭黑粉菌致病相关基因pep1的基础上进行了较为系统的研究,如信号肽功能鉴定、压力应激响应、基因表达量分析、致病力鉴定、接种后DAB显色分析、蛋白体外互作、酵母双杂交等,取得如下主要结果:***1蛋白的信号肽具有引导分泌功能,表明Pep1可能是一个效应物;***1基因的缺失对甘蔗鞭黑粉菌在正常培养基上的生长无明显影响,也不改变其对高渗透压条件、氧化条件以及细胞壁的完整性逆境条件下的应激反应;***1基因敲除株中的有性配合相关基因bE、bW、pra、mfa和prf的转录水平显著降低,其有性配合能力也比野生型菌株明显降低;4.单配合型pep1基因敲除株显著降低其配合后二倍体菌丝的致病力;5.缺失pep1的甘蔗鞭黑粉菌可以增强甘蔗叶片接种位点ROS的爆发反应;6.原核表达的Pep1蛋白具有抑制甘蔗过氧化物酶Pod-1a活性的作用,但在体外,带有信号肽序列的Pep1蛋白与Pod-1a蛋白没有相互作用。本研究对甘蔗鞭黑粉菌的效应物蛋白基因pep1敲除株进行研究,发现该基因缺失对甘蔗鞭黑粉菌生长、配合及致病力具有影响;对甘蔗鞭黑粉菌效应物蛋白Pep1与宿主蛋白的互作进行研究,发现了Pep1蛋白在对甘蔗的侵染中的作用机制。本研究旨在揭示甘蔗鞭黑粉菌的致病机理,同时为甘蔗黑穗病的防治提供一定的理论基础。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌效应物蛋白酵母双杂交 Pep1 有性配合致病力

甘蔗鞭黑粉菌二态型转变抑制剂筛选及作用机理初步研究

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甘蔗鞭黑粉菌二态型转变抑制剂筛选及作用机理初步研究

作者：钟月华南农业大学

学位级别：硕士

病原真菌的形态学转变与其致病性密切相关,甘蔗鞭黑粉菌酵母态单细胞经有性配合后形成的菌丝态是其致病的关键。真菌的二态型转化(dimorphic switch)是真菌通过其信号传导系统感受环境信号因子并将其传递至细胞内,引起特定的功能基因表... 详细信息

病原真菌的形态学转变与其致病性密切相关,甘蔗鞭黑粉菌酵母态单细胞经有性配合后形成的菌丝态是其致病的关键。真菌的二态型转化(dimorphic switch)是真菌通过其信号传导系统感受环境信号因子并将其传递至细胞内,引起特定的功能基因表达。黑粉菌是一种典型的二态型真菌,单倍体是无致病力的酵母态单细胞,经有性配合(sexual mating)形成双核菌丝体,双核菌丝体可侵染寄主并引发病害。从天然产物中筛选具有抑制黑粉菌二态型转变的新型活性化合物,明确化合物的作用靶点和作用机制对阐明黑粉菌二态型转化的信号调控通路具有重要的意义。目前尚未有针对黑粉菌二态型转变的抑制剂的相关研究报道。为解决这一科学问题,我们从实验室的100个化合物(包括有机合成来源和天然提取分离来源)中,发现一类新的酚酸类化合物具有显著抑制甘蔗鞭黑粉菌二态型转变的活性,从而大大降低其致病性。通过进一步的转录组测序和分析,实时荧光定量分析,以及目的基因敲除等实验,初步明确了该类化合物抑制活性的作用机理。主要研究结果如下:1.从100多个化合物中,筛选到一类酚酸类天然产物具有显著抑制甘蔗鞭黑粉菌二态型转变的活性,MEC值(最低有效浓度Minimum Effective Concentration)在0.9-42mM之间。其中化合物PB-1活性最好(MEC值为0.92mM)。该类化合物在最低有效浓度下,对黑粉菌的生长没有影响。此外,化合物PB-1还对甘蔗鞭黑粉菌冬孢子萌发有抑制作用。2.将化合物PB-1分别处理4 h、8 h和12 h后的甘蔗鞭黑粉菌进行转录组测序分析,结果发现大部分差异基因都与氨基酸代谢有关,特别是酪氨酸代谢和组胺代谢。通过实时荧光定量对甘蔗鞭黑粉菌有性配合相关基因进行检测,发现pra1、prf1、b E和mfa1基因表达量降低,结合转录组数据,确认化合物PB-1的作用靶标是c AMP-PKA有性配合通路。3.通过同源基因克隆技术获得了甘蔗鞭黑粉菌两个交配型MAT-1和MAT-2 Ss16基因全长序列。MAT-1和MAT-2 Ss16基因长度为1346 bp,两者同源性为98%。与Sporisorium reilianum、Ustilago maydis、Ustilago bromivora同源性分别为89%、86%和83%。与Ustilago maydis、Sporisorium reilianum、Ustilago bromivora、Kalmanozyma brasiliensis、Pseudozyma hubeiensis、Ustilago hordei、Moesziomyces antarcticus、Melanopsichium pennsylvanicum八种植物病原菌进行系统进化分析,结果表明Ss16与***和Moesziomyces antarcticus同源性较高,处于同一分支,而与***、***和***亲缘性相对较远,但同在一个大的进化簇内。4.构建甘蔗鞭黑粉菌MAT-2 Ss16基因敲除载体,利用农杆菌介导转化黑粉菌转化,对Ss16基因进行敲除。通过有性配合检测发现Ss16基因的缺失对甘蔗鞭黑粉菌菌丝化形成有影响,经RT-q PCR分析,发现Ss16基因的缺失突变体中pra2、prf1和mfa2基因都显现明显下调的趋势,pde1、pde2和Ubc1显著上调,因而表明Ss16基因可能与c AMP-PKA上下游基因相关。以上结果表明,PB-1可能开发成为一种新型的生防制剂。它在不影响黑粉菌生长的情况下,抑制甘蔗鞭黑粉菌中有性配合通路中相关pra1、prf1、mfa1和b E位点基因的表达,从而进一步影响甘蔗鞭黑粉菌由酵母态向菌丝态的转变,最终降低其致病能力达到有效的防控作用。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌二态型转变抑制剂有性配合致病性

甘蔗鞭黑粉菌两个有性配合缺陷突变体目标基因的分离与鉴定

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甘蔗鞭黑粉菌两个有性配合缺陷突变体目标基因的分离与鉴定

作者：张小萌华南农业大学

学位级别：硕士

由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗鞭黑穗病是一种重要的甘蔗病害,已对我国甘蔗糖业造成严重的影响。开展该病菌有性配合与致病相关基因的分离与功能鉴定,可为从分子水平上了解甘蔗鞭黑粉菌的致病机制及病菌与甘蔗的... 详细信息

由甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum)引起的甘蔗鞭黑穗病是一种重要的甘蔗病害,已对我国甘蔗糖业造成严重的影响。开展该病菌有性配合与致病相关基因的分离与功能鉴定,可为从分子水平上了解甘蔗鞭黑粉菌的致病机制及病菌与甘蔗的相互作用提供依据,同时也可为抗病育种提供理论基础和技术支撑。本研究以甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株WT18和WT17为出发菌株,用根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)方法,建立了拥有13000个具有潮霉素抗性的T-DNA随机插入突变体库;经营养平板上有性配合试验,筛选获得了12个有性配合能力缺陷突变体,PCR验证和Southern杂交分析结果表明T-DNA插入在甘蔗鞭黑粉菌基因组中且均为单拷贝插入。随机挑选3个出自WT18的缺乏有性配合能力突变体33、91和14137及1个出自WT17的有性配合能力明显减弱突变体6425与相对性系野生型菌株菌体等量混合后注射接种甘蔗苗,结果表明野生型发病率为100%、突变体91和突变体6425发病率为26.67%,而突变体33和14137则不能使甘蔗苗发病。利用hiTAIL-PCR技术对其中突变体6425和33的T-DNA插入基因进行扩增并以发表的基因组序列进行比对分析,结果显示突变体6425的T-DNA插入在g5893基因的启动子区域,该基因与维持端粒覆盖的作用相关;突变体33的T-DNA插入在g4800基因的启动子区,该基因可能与甾醇Δ5,6-去饱和酶的作用相关。qRT-PCR检测显示在突变体6425中,g5893基因的表达降低60%;在突变体33中,g4800基因表达降低了50%。运用split marker的方法,根据g5893基因和g4800基因的侧翼序列以及潮霉素序列,分别设计了4对特异性引物,构建了用于同源敲除的融合PCR片段;通过PEG转化和对转化子的筛选验证,成功获得了突变体6425的敲除突变体Δg5893和33的敲除突变体Δg4800。在MM培养平板上敲除突变体Δg5893的配合能力弱于野生型,且对过氧化氢不敏感,对高盐的耐受能力降低。而敲除突变体Δg4800的配合能力和野生型没有差异,表明基因g4800与甘蔗鞭黑粉菌有性配合能力无关,基因g4800也不是原突变体33中T-DNA插入突变所影响的有性配合相关基因。

关键词：甘蔗鞭黑粉菌有性配合 g5893基因 g4800基因