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中国生物工程杂志 2011年第6期31卷 75-80页

作者：权国燕方慧英诸葛斌张波姚佳佳诸葛健江南大学生物工程学院工业微生物研究中心无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122 江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡214122

甘油脱水酶是甘油转化3-羟基丙酸生物合成途径中的关键性限速酶,然而底物甘油的存在会抑制该酶的活性,从而引起3-羟基丙酸合成量的下降。因此解除底物甘油对甘油脱水酶活性的抑制作用,是提高生物合成3-羟基丙酸产量的方法之一。克隆来... 详细信息

甘油脱水酶是甘油转化3-羟基丙酸生物合成途径中的关键性限速酶,然而底物甘油的存在会抑制该酶的活性,从而引起3-羟基丙酸合成量的下降。因此解除底物甘油对甘油脱水酶活性的抑制作用,是提高生物合成3-羟基丙酸产量的方法之一。克隆来源于克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的甘油脱水酶编码基因dhaB、甘油脱水酶再激活因子编码基因gdrA、gdrB,以及来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeW303)的乙醛脱氢酶编码基因aldH,分别构建了基因工程菌Escherichia coliJM109/pEtac-dhaB-tac-aldH和***109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH,考察甘油脱水酶再激活因子对3-羟基丙酸生物合成的影响。在好氧条件下发酵28小时,***109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH与***109/pEtac-dhaB-tac-aldH3-羟基丙酸合成量分别为4.0 g/L和0.54 g/L,前者与后者相比,3-羟基丙酸合成量提高了6.4倍。研究结果表明,甘油脱水酶再激活因子能有效激活甘油脱水酶的活性从而提高了目标产物3-羟基丙酸的生物合成量。

关键词：甘油重组大肠杆菌 3-羟基丙酸甘油脱水酶甘油脱水酶再激活因子

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3-羟基丙酸合成过程中关键途径的构建及优化

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作者：程秀丽浙江工业大学

学位级别：硕士

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)是乳酸的羟基异构体,是合成很多医药化工中间体的重要前体物质,具有广泛的应用前景。但目前生物法利用甘油合成3-HP最主要的问题是其产量还未达到工业化水平,因此构建性能优良的基因工程菌株... 详细信息

3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,3-HP)是乳酸的羟基异构体,是合成很多医药化工中间体的重要前体物质,具有广泛的应用前景。但目前生物法利用甘油合成3-HP最主要的问题是其产量还未达到工业化水平,因此构建性能优良的基因工程菌株是目前的主要研究方向。本研究以大肠杆菌Escherichia Coli BL21(DE3)为出发菌株,构建了合成3-HP的代谢路径,引入了甘油脱水酶再激活因子GDR和辅酶NAD+再生途径,并在基因组上为合成乙酰Co A的基因acs更换了trc强启动子,最后对构建的基因工程菌发酵生产3-HP能力进行了考察,具体研究内容如下:1.克隆来源于Klebsiella pneumoniae DSM 2026甘油脱水酶基因dha B及再激活因子基因gdr A,采用不同的表达载体构建了重组质粒p ETDuet-dha B1-4、p ET28a-dha B1-4和p CDFDuet-dha B1-4;*** BL21(DE3)(p ET-28a-dha B1-4/p ETDuet-dha B1-4/p CDFDuet-dha B1-4)甘油脱水酶酶活依次为11.56 U/mg、7.94 U/mg和6.94 U/mg。同时克隆表达来自Cupriavidus necator的醛脱氢酶基因Gab D4,得到重组质粒p CDFDuet-tac-GABab D4。与实验室前期构建的含有Azospirillum brasilense的内源性基因α-酮戊二酸半醛脱氢酶的重组质粒p CDFDuettac-Tukgsadh比较,酶活分别为*** BL21(DE3)p CDFDuet-tacTUkgsadh:3.11 U/mg,*** BL21(DE3)p CDFDue-tac-Gab D4:1.71U/mg。共表达得到工程菌株*** BL21(DE3)(p CDFDuet-tacTUkgsadh/p ET-28a-dha B1-4)、*** BL21(DE3)(p CDFDuet-tacTUkgsadh/p ETDuet-dha B1-4)、*** BL21(DE3)(p CDFDue-tacGab D4/p ET28a-dha B1-4)和*** BL21(DE3)(p CDFDuet-tacGab D4/p ETDuet-dha B1-4)。在摇瓶发酵培养基中培养38h,3-HP的最高产量分别为0.37 g/L、1.14 g/L、0.31 g/L和0.86 g/L。说明使甘油脱水酶和醛脱氢酶分别在不同拷贝数的质粒上表达来平衡二者的酶活,更适合3-HP的合成。2.为提高3-HP的产量,进一步优化了其合成途径,包括甘油脱水酶再激活因子和辅酶NAD+再生途径的引入以及乙酰Co A启动子的更换。克隆来源于*** DSM 2026中的甘油脱水酶再激活因子基因gdr B,构建了*** BL21(DE3)(p CDFDuet-tac-TUkgsadh/p ETDuet-tacdha B-gdr AB),在摇瓶发酵培养基中培养38 h后3-HP产量提高到5.12g/L,相较之前提高了4.5倍。与前期构建的辅酶再生的串联重组质粒p CDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和p CDFDuet-tac-sth A-TUkgsadh共表达后,摇瓶发酵38 h后,结果显示添加了辅酶再生基因后的工程菌,3-HP的产量反而降低,通过分析发现3-HP产量降低的主要原因是表达sth A和gpd1两个基因后,由于代谢途径中氧化还原力的不平衡导致途径中缺乏NAD+,从而降低了醛脱氢酶的活性。除此之外,乙酰Co A合成过程中可以通过三羧酸循环经氧化磷酸化释放出大量的ATP供细胞生长和物质合成,因此本实验采用CRISPR-Cas9基因编辑系统将合成乙酰Co A基因acs的启动子替换为trc强启动子,构建了*** BL21(DE3)T(p CDFDuet-tac-TUkgsadh/p ETDuet-tac-dha B-gdr AB),该工程菌株发酵培养38 h后,3-HP产量达到5.5 g/L,菌株生长状况良好,提前达到了稳定期。3.以工程菌*** BL21(DE3)T(p CDFDuet-tac-TUkgsadh/p ETDuettac-dha B-gdr AB)为出发菌株,优化了5 L发酵罐中3-HP的发酵工艺,发酵过程中控制p H稳定在7.0,3-HP产量为8.79 g/L,比p H不控制的情况提高了68%。在p H恒定为7.0的基础上,在甘油浓度下降至15g/L时开始添加,并维持甘油浓度在15-20 g/L之间,发酵结束后3-HP产量达到12.11 g/L

关键词： 3-羟基丙酸甘油脱水酶甘油脱水酶再激活因子醛脱氢酶辅酶再生双酶共表达

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3-羟基丙酸合成途径关键酶及再激活因子基因在大肠杆菌中的表达研究

3-羟基丙酸合成途径关键酶及再激活因子基因在大肠杆菌中的表达研...

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作者：权国燕江南大学

学位级别：硕士

3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid, 3-HP）是一种重要的平台化合物,以它为出发原料能合成多种化工产品及日用品。微生物转化法合成3-羟基丙酸因其成本低,条件温和,绿色环保等优势有着广泛的应用前景。随着基因工程技术的发展,利用... 详细信息

3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid, 3-HP）是一种重要的平台化合物,以它为出发原料能合成多种化工产品及日用品。微生物转化法合成3-羟基丙酸因其成本低,条件温和,绿色环保等优势有着广泛的应用前景。随着基因工程技术的发展,利用基因工程技术对菌种进行改造,是实现生物法利用可再生资源转化生产3-HP工业化的重要手段之一。而目前关于生物法生产3-羟基丙酸的研究尚处于起步阶段,相关报道并不多见。本课题利用分子生物学技术对甘油转化生产3-羟基丙酸代谢途径中的关键酶基因在大肠杆菌中的表达进行研究。利用克隆技术获得甘油转化为3-羟基丙酸代谢途径中的关键酶基因——来源于酿酒酵母的乙醛脱氢酶编码基因aldH,以及来源于克雷伯氏菌的甘油脱水酶基因dhaB,将3-羟基丙酸合成关键酶基因aldH、dhaB进行串联,构建含双tac启动子的串表达载体pEtac-dhaB-tac-aldH,将其转入*** JM109中获得产3-羟基丙酸重组菌*** JM109/pEtac-dhaB-tac-aldH。经SDS-PAGE鉴定,关键酶基因得到正确表达。以已构建的产3-羟基丙酸关键酶基因共表达的重组菌*** JM109/pEtac-dhaB, pUC-tac-aldH作为对照,与构建的产3-羟基丙酸关键酶基因串表达的重组大肠杆菌进行关键酶的活性、重组质粒的稳定性以及产物3-羟基丙酸的合成量的对比。结果表明,产3-羟基丙酸关键酶基因串表达的重组菌*** JM109/pEtac-dhaB-tac-aldH与共表达重组菌*** JM109/pEtac-dhaB, pUC-tac-aldH相比,表达的甘油脱水酶DHAB的活性提高了41.5%,乙醛脱氢酶ALDH的活性提高了3.5%;串表达重组质粒的稳定性提高了29.4%;最终3-羟基丙酸的合成量提高了52.6%。研究结果表明,串表达关键酶基因有利于重组大肠杆菌合成3-羟基丙酸。甘油脱水酶是甘油转化3-羟基丙酸生物合成途径中的关键性限速酶,然而底物甘油的存在会抑制该酶的活性。因此解除底物甘油对甘油脱水酶活性的抑制作用,是提高生物合成3-羟基丙酸产量的方法之一。本研究克隆了来源于克雷伯氏菌基因组中,编码DHAB基因的甘油脱水酶再激活酶基因gdrA、gdrB,并重新构建串联有gdrA、gdrB、dhaB、aldH基因的表达质粒pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH,获得重组菌*** JM109/ pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH。进一步考察甘油脱水酶再激活因子对3-羟基丙酸生物合成的影响。在好氧条件下发酵, E. coli JM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH的3-羟基丙酸合成量为2.51 g/L,与E. coli JM109/pEtac-dhaB-tac-aldH相比,3-羟基丙酸合成量提高了3.3倍。经初步发酵优化后E. coli JM109/pEtac-dhaB-gdrAB-tac-aldH的3-HP合成量为4.01 g/L ,比优化前提高了60%。研究结果表明,甘油脱水酶再激活因子能有效激活甘油脱水酶的活性从而提高了目标产物3-羟基丙酸的生物合成量。

关键词：甘油 3-羟基丙酸甘油脱水酶乙醛脱氢酶甘油脱水酶再激活因子大肠杆菌

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