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黑龙江畜牧兽医 2022年第21期 11-15,22,135页

作者：王一妹徐鹏姜南李世杰马兴红东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 哈尔滨医科大学附属第二医院哈尔滨150001

为了探讨卵巢激素是否影响甘氨酰-trna合成酶(Gars)在小鼠子宫的表达,试验将12只小鼠切除卵巢后随机分成4组,分别为E2组(注射E2100 ng)、P4组(注射P42 mg)、E2+P4组(注射E2100 ng和P42 mg)和Oil组(注射芝麻油0.1 mL),采用mRNA原位杂交... 详细信息

为了探讨卵巢激素是否影响甘氨酰-trna合成酶(Gars)在小鼠子宫的表达,试验将12只小鼠切除卵巢后随机分成4组,分别为E2组(注射E2100 ng)、P4组(注射P42 mg)、E2+P4组(注射E2100 ng和P42 mg)和Oil组(注射芝麻油0.1 mL),采用mRNA原位杂交、实时荧光信号颜色定量PCR、免疫组织化学和Western-blot分析等方法,从基因和蛋白质水平对Gars在小鼠子宫的表达进行定位和定量研究。结果表明:加入碱性磷酸酶显色底物NBT/BCIP后,E2组信号颜色为深棕色(偏黑),P4组及E2+P4组为浅棕色,Oil组仍为绿色;与注射芝麻油相比,E2及E2+P4可上调切除卵巢小鼠子宫Gars基因的表达(P0.05);加入免疫组织化学显色底物DAB后,E2组、E2+P4组信号颜色为深棕色,Oil组为浅棕色,P4组为蓝色;与注射芝麻油相比,E2及E2+P4可上调切除卵巢小鼠子宫Gars蛋白的表达P<0.05),P4则显著下调切除卵巢小鼠子宫Gars蛋白的表达(P<0.05)。说明Gars的表达受到卵巢类固醇激素的调控。

关键词：甘氨酰-trna合成酶卵巢激素小鼠子宫胚胎着床

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氨基酰-trna合成酶与神经退行性疾病

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生物化学与生物物理进展 2007年第6期34卷 562-566页

作者：朱斌王恩多中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所分子生物学国家重点实验室上海200031

氨基酰-trna合成酶催化trna的氨基酰化反应为生物体内的蛋白质合成提供原料.这类古老且保守的蛋白质分子在高等生物复杂的细胞分子网络中分化出的新功能是目前人们关注的焦点.近期在对一些患有神经退行性疾病的病人和小鼠模型的研究中发... 详细信息

氨基酰-trna合成酶催化trna的氨基酰化反应为生物体内的蛋白质合成提供原料.这类古老且保守的蛋白质分子在高等生物复杂的细胞分子网络中分化出的新功能是目前人们关注的焦点.近期在对一些患有神经退行性疾病的病人和小鼠模型的研究中发现,位于酪氨酰-trna合成酶、甘氨酰-trna合成酶和丙氨酰-trna合成酶上的突变,可分别导致DI腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Toothdisease,CMT)C型,腓骨肌萎缩症2D型及小脑浦肯雅(Purkinje)细胞丢失.初步的致病机理研究表明,致病突变对这3种酶的影响各不相同:酪氨酰-trna合成酶的氨基酰化催化能力受到影响,甘氨酰-trna合成酶受影响的可能是一种未知的新功能,而丙氨酰-trna合成酶受影响的则是它的编校功能.这些研究结果揭示了氨基酰-trna合成酶涉及神经退行性疾病的广泛性和其机制的复杂性,并将促进对神经退行性疾病这一类常见疾病的病理和治疗方法的研究.

关键词：氨基酰-trna合成酶酪氨酰-trna合成酶甘氨酰-trna合成酶丙氨酰-trna合成酶神经退行性疾病腓骨肌萎缩症浦肯雅(Purkinje)细胞

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AcMNPV GP41与Sf9细胞CHCHD2和GARS蛋白相互作用关键位点识别及其对病毒复制的影响

AcMNPV GP41与Sf9细胞CHCHD2和GARS蛋白相互作用关键位点识别及其...

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作者：王素丹华中师范大学

学位级别：硕士

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclepolyhedrovirus,AcMNPV)GP41是一种O-糖基化蛋白,定位于病毒粒子的囊膜与核衣壳之间。研究表明gp41是核衣壳出核获取囊膜的必需基因,但具体作用机制尚不清楚。本实验... 详细信息

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nuclepolyhedrovirus,AcMNPV)GP41是一种O-糖基化蛋白,定位于病毒粒子的囊膜与核衣壳之间。研究表明gp41是核衣壳出核获取囊膜的必需基因,但具体作用机制尚不清楚。本实验室前期利用酵母双杂交技术从Sf9 cDNA文库中筛查出两个可能与GP41相互作用的蛋白:含卷曲-卷曲-螺旋-卷曲-卷曲-螺旋结构域蛋白2 CHCHD2同源物和甘氨酰-trna合成酶GARS同源物。初步确定GP41与CHCHD2和GARS之间的相互作用区段分别位于GP41 AA161-210和AA81-330之间。本文进一步探究GP41与这两种宿主蛋白相互作用的关键氨基酸位点以及GP41与这两种宿主蛋白相互作用对病毒复制的影响。首先,通过免疫共沉淀和双分子荧光互补实验验证GP41与CHCHD2和GARS之间的相互作用。在免疫共沉淀实验中,将HA标签抗体与先后用包含HA标签的chchd2瞬时表达质粒转染和AcMNPV感染的Sf9细胞裂解物混合后,从所获得的免疫沉淀物中分别检测出GP41和HA-CHCHD2。在双分子荧光互补实验中,在表达GP41-黄色荧光蛋白YFP C155的融合蛋白和YFP N173-CHCHD2/GARS融合蛋白的报告病毒感染的Sf9细胞中分别观察到黄色荧光。表达GP41-YFP C155和YFP N173-CHCHD2细胞中黄色荧光分布在细胞核周缘;表达GP41-YFP C155和YFP N173-GARS细胞中黄色荧光主要分布在细胞质中。在GP41AA81-330区间内选取K137、M145、L152、L242和L290五个保守氨基酸密码子进行点突变。酵母双杂交实验结果显示:K137A×CHCHD2和M145A×CHCHD2杂合子在四缺选择培养基平板上只长出个别菌落;L290A×CHCHD2和L290A×GARS平板未长出菌落;K137A×GARS、M145A×GARS、L152A×GARS 和L152A×CHCHD2平板菌落明显减少;L242A×CHCHD2和L242A×GARS平板可见大量菌落。双分子荧光互补实验结果显示表达K137A/M145A-YFP C155融合蛋白和YFP N173-GARS融合蛋白的报告bacmids转染的Sf9细胞中呈现黄色荧光;表达K137A/M145A/L290A-YFP C155融合蛋白和 YFP N173-CHCHD2 融合蛋白的报告bacmids以及表达L290A-YFP C155融合蛋白和YFP N173-GARS融合蛋白的报告bacmid转染的Sf9细胞中未见黄色荧光。这些现象表明K137、M145和L290对GP41与CHCHD2的相互作用,L290对GP41与GARS的相互作用至关重要。这些位点的突变导致GP41与CHCHD2或GARS的相互作用消失。为了检测GP41 K137、M145、L152、L242和L290位点对病毒复制的影响,我们构建了带有polh标签和带egfp标签的AcMNPV gp41突变体用于对Sf9细胞的转染-感染实验。在带polh标签的野生型、gp41缺失-回复突变体以及gp41 L152A和L242A突变体转染的细胞培养皿中绝大多数细胞中可见大量包涵体,而K137A、M145A和L290A突变体转染的细胞培养皿中只有个别细胞可见少量包涵体;用K137A、M145A和L290A转染细胞培养上清感染的细胞中未见包涵体。同样,用带egfp标签的gp41 K137A、M145A和L290A转染细胞培养上清感染的细胞中也未呈现绿色荧光。这些结果表明gp41K137A、M145A和L290A突变体不能产生感染性芽殖病毒体,但能够产生包涵体。为了探究GP41互作蛋白GARS对病毒复制的影响,采用RNAi技术干扰被AcMNPV感染的Sf9细胞gars基因表达,检测干扰对病毒芽殖病毒体增殖的影响。用构建的表达gars反向重复序列的重组病毒感染Sf9细胞,荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,包含gars反向重复序列的重组病毒感染细胞的gars mRNA降低66%。病毒增殖结果显示,在被感染Sf9细胞中重组病毒滴度在所有时间点均低于野生型病毒;在感染后96小时重组病毒达到的峰值水平只有野生型病毒滴度的20%。该项结果表明,AcMNPV病毒复制依赖宿主gars基因的正常表达。上述实验结果表明:(1)AcMNPV GP41与Sf9细胞蛋白CHCHD2和GARS发生相互作用;(2)K137、M145和L290是GP41与CHCHD2相互作用的关键位点,L290是GP41与GARS的相互作用关键位点;(3)GP41与宿主细胞CHCHD2和GARS蛋白的相互作用对于病毒复制至关重

关键词：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 GP41 杆状病毒-宿主蛋白相互作用含卷曲-卷曲-螺旋-卷曲-卷曲-螺旋结构域蛋白2 甘氨酰-trna合成酶

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