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瑟氏泰勒虫感染的牛外周血单个核细胞酵母双杂交cDNA文库构建及鉴定

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畜牧与兽医 2015年第9期47卷 65-68页

作者：董亮张守发许应天于龙政李积旭贾立军薛书江延边大学农学院动物医学系吉林延吉133002

为了研究牛瑟氏泰勒虫与牛外周血单个核细胞之间蛋白的相互作用,以自然感染瑟氏泰勒虫的牛外周血单个核细胞为材料,纯化并提取总RNA,应用SMART技术合成双链cD NA（ds cD NA）。利用纯化柱纯化ds cD NA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵... 详细信息

为了研究牛瑟氏泰勒虫与牛外周血单个核细胞之间蛋白的相互作用,以自然感染瑟氏泰勒虫的牛外周血单个核细胞为材料,纯化并提取总RNA,应用SMART技术合成双链cD NA（ds cD NA）。利用纯化柱纯化ds cD NA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛外周血单个细胞的酵母双杂交cD NA表达文库。结果显示,文库容量为4.0×108CFU/mL,随机挑取单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链cD NA片段大小集中在0.4-2.0 kb,文库重组率为95%。表明此文库达到要求,可用于酵母双杂交筛选。

关键词：瑟氏泰勒虫外周血单个核细胞酵母双杂交 cDNA文库

瑟氏泰勒虫p33基因与牛IL-18基因的串联表达

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中国兽医学报 2016年第9期36卷 1527-1530页

作者：海旭南宋建臣李海峰薛书江许应天延边大学农学院吉林延吉133002

为研究牛IL-18基因对瑟氏泰勒虫p33疫苗的免疫佐剂效应,根据GenBank上已经发表的p33基因序列和牛IL-18基因序列(IL-18)设计2对特异性引物,以瑟氏泰勒虫基因组DNA和pMD-19-T-IL-18质粒DNA为模板,采用SOE-PCR技术将2个基因连接在一起,经B... 详细信息

为研究牛IL-18基因对瑟氏泰勒虫p33疫苗的免疫佐剂效应,根据GenBank上已经发表的p33基因序列和牛IL-18基因序列(IL-18)设计2对特异性引物,以瑟氏泰勒虫基因组DNA和pMD-19-T-IL-18质粒DNA为模板,采用SOE-PCR技术将2个基因连接在一起,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,获得1 416bp的目的基因IL-18-p33,克隆于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了双基因重组表达载体pGEX-4T-1-IL-18-p33,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出预期大小为79 000的融合蛋白。Western blotting检测结果显示,该蛋白与瑟氏泰勒虫抗血清呈阳性反应,表明融合蛋白具有反应原性,为进一步研究IL-18对瑟氏泰勒虫p33基因疫苗的免疫佐剂效应奠定了基础。

关键词：瑟氏泰勒虫 p33基因牛IL-18基因串联表达

瑟氏泰勒虫p23与牛IL-18复合基因真核表达载体的构建与瞬时表达

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中国兽医学报 2015年第6期35卷 922-925页

作者：孙平杰宋建臣李海峰许应天延边大学农学院吉林延吉133202

为构建瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因真核表达质粒,以pMD-18T-p23和pMD-18T-IL-18克隆质粒为模板,应用重组PCR技术得到瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因,将其先克隆到pMD-18-T载体,再亚克隆到真核表达载体pVAXⅠ中,得到重组质粒pVAXI-P23-IL... 详细信息

为构建瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因真核表达质粒,以pMD-18T-p23和pMD-18T-IL-18克隆质粒为模板,应用重组PCR技术得到瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因,将其先克隆到pMD-18-T载体,再亚克隆到真核表达载体pVAXⅠ中,得到重组质粒pVAXI-P23-IL-18。对该重组质粒进行PCR、酶切鉴定及测序后,采用脂质体法将其转染到BHK-21细胞,用RT-PCR和IFA进行鉴定。结果表明,瑟氏泰勒虫p23-IL-18复合基因真核表达质粒pVAXIP23-IL-18构建成功,可在BHK-21细胞中表达。本试验为p23-IL-18复合基因的免疫学研究奠定了基础。

关键词：瑟氏泰勒虫 p23基因牛IL-18 串连基因真核表达

瑟氏泰勒虫p33基恩与牛IL-18基的串联表达

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瑟氏泰勒虫p33基恩与牛IL-18基的串联表达

作者：海旭南延边大学

学位级别：硕士

瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)是泰勒科、泰勒属的血液原虫,寄生在红细胞内。感染泰勒虫的牛主要表现为慢性贫血、高热、消瘦和淋巴结肿大等临床症状,感染泰勒虫的牛只由于贫血导致免疫力下降,极易引起其他血液性疾病的病原体的继发感... 详细信息

瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)是泰勒科、泰勒属的血液原虫,寄生在红细胞内。感染泰勒虫的牛主要表现为慢性贫血、高热、消瘦和淋巴结肿大等临床症状,感染泰勒虫的牛只由于贫血导致免疫力下降,极易引起其他血液性疾病的病原体的继发感染,进而导致死亡率的升高,给养牛产业造成不可避免的经济损失。近年来,随着中国牛养殖业的蓬勃发展,瑟氏泰勒虫的发病率在全国范围内的各个地区呈以惊人的速度呈上升趋势,给全国各地区的养牛产业造成巨大的经济威胁。因此,有效控制瑟氏泰勒虫的发病率成为当务之急。本试验将瑟氏泰勒虫主要表面抗原p33基因与牛白细胞介素18(IL-18)基因进行重组表达,结果表明表达出的重组蛋白IL-18-p33具有相当好的反应原性。瑟氏泰勒虫的p33基因是瑟氏泰勒虫的主要表面蛋白之一,能够引起宿主的良好的特异性免疫反应。根据GenBank上已经发表的p33基因序列[GenBank: DQ078264.1]白细胞介素18基因序列(IL-18) [GenBank:EU574909.1]分别设计两对特异性引物。提取感染瑟氏泰勒虫牛的阳性抗凝血液DNA,并以血液DNA为模板应用聚合酶链式反应技术(即PCR技术)扩增得到大小为821bp大小左右的目的片段。提取pMD-18-T-IL-18质粒DNA,以该质粒DNA为模板,通过PCR技术,得到大小为627 bp目的片段。应用SOE-PCR技术将两段基因串联,得到串联基因IL-18-p33,大小为1416 bp。将经SOP-PCR技术得到的串联基因片段与pMD-19-T simple载体连接,然后转化至大肠杆菌的克隆菌种DH5a。提取质粒DNA,质粒DNA经过PCR?BamH I, Xho I双酶切和测序确定串联基因IL-18-p33成功与pMD-19-T simple载体连接后,将该重组质粒命名为pMD-19T-IL18-p33。将质粒pMD-19T-IL18-p33和原核表达载体pGEX-4T1经过BamH I和Xho I双酶切,分别回收酶切后的IL18-p33和pGEX-4T1的目的条带,然后进行16℃过夜连接,并转化至大肠杆菌表达的菌株BL21,提取质粒DNA后进行质粒PCR鉴定和BanH I、 Xho I双酶切鉴定,并将其命名为BL21-pGEX4T1-IL18-p33。对BL21-pGEX4T1-IL18-p33进行1/1000浓度的IPTG诱导表达。将诱导产物进行SDS-PAGE凝胶电泳分析,结果在66.4 kDa与97.2 kDa之间出现一条79 kDa左右大小条带,且与预期结果大小相符。然后将表达的蛋白IL-18-p33进行Western blot分析,结果表明IL-18-p33蛋白具有相当好的反应原性。

关键词：瑟氏泰勒虫串联基因IL-18-p33 原核表达

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瑟氏泰勒虫p33基因在酵母菌中的表达

瑟氏泰勒虫p33基因在酵母菌中的表达

作者：孙兴忠延边大学

学位级别：硕士

瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti)是寄生于牛体内的一种血液原虫,是泰勒虫科、泰勒虫属,主要寄生于牛的淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞中,通过蜱进行传播。现阶段,随着养牛业的不断发展,牛的瑟氏泰勒虫病近几年发生频率呈现上升趋势,对养牛... 详细信息

瑟氏泰勒虫(Theileriasergenti)是寄生于牛体内的一种血液原虫,是泰勒虫科、泰勒虫属,主要寄生于牛的淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞中,通过蜱进行传播。现阶段,随着养牛业的不断发展,牛的瑟氏泰勒虫病近几年发生频率呈现上升趋势,对养牛业的危害极大。但到目前为止还没有特效药物用于瑟氏泰勒虫病的治疗和预防,而且尚无该病的疫苗。瑟氏泰勒虫p33基因,是该虫体的主要表面蛋白基因,具有较好的免疫原性和反应原性,认为是较理想的候选抗原。真核表达系统,除了具备原核表达系统的优点外,还具有表达外源蛋白量高、遗传性状稳定、产物提纯简单等诸多优点,受到越来越多的人青睐。本试验根据Genbank中***33基因中国株序列,设计一对特异性引物,用常规PCR扩增出大小为786 bp的p33目的基因片段,将其克隆到pMD-19-T载体上,构建pMD-19-T-p33重组克隆质粒,经PCR、双酶切鉴定测序分析,证实目的片段正确地克隆到pMD-19-T载体上。然后将p33基因亚克隆到酵母表达载体pPICZaA上,重组质粒经PCR、EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定,证实成功构建含有目的基因片段的真核表达载体pPICZα A-p33。然后将其转化到GS115酵母感受态细胞中,最终通过800μg/ml浓度的博来霉素筛选得到高拷贝重组子,经PCR筛选阳性菌株后,通过最终浓度为1%的甲醇诱导并在毕赤酵母中大量表达外源蛋白,然后对诱导产物进行SDS-PAGE,得到大小为29.67Ku的蛋白,与预期结果相符合。而后对诱导蛋白进行Western blot反应原性鉴定,蛋白可以被牛瑟氏泰勒虫的阳性血清特异性识别,表明得到的蛋白具有较好的反应原性。本试验结果为以后瑟氏泰勒虫病诊断试剂盒、瑟氏泰勒虫p33基因的单克隆抗体和瑟氏泰勒虫病疫苗研究等研究打下坚实的基础。

关键词：瑟氏泰勒虫 p33基因真核表达毕赤酵母

瑟氏泰勒虫p33基因PCR-ELISA检测方法的建立及初步应用

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瑟氏泰勒虫p33基因PCR-ELISA检测方法的建立及初步应用

作者：孙静延边大学

学位级别：硕士

瑟氏泰勒虫病是瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)寄生于牛的红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞内的血液原虫病,以长角血蜱为传播媒介。牛感染此虫体后在临床上表现出高稽留热、贫血、消瘦、出血以及体表淋巴结肿大等症状。该病可影响母牛产后... 详细信息

瑟氏泰勒虫病是瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)寄生于牛的红细胞、巨噬细胞和淋巴细胞内的血液原虫病,以长角血蜱为传播媒介。牛感染此虫体后在临床上表现出高稽留热、贫血、消瘦、出血以及体表淋巴结肿大等症状。该病可影响母牛产后的出奶量及降低出生小牛的存活率,主要分布在东北亚地区,危害十分严重,给养牛业带来严重的经济损失。近几年,随着全球经济迅速发展,养牛业逐渐扩大,瑟氏泰勒虫病的流行区也随之扩大,给各地区以及全国的畜牧业带来不可挽回的经济损失,引起兽医界的广泛关注。因此,监控、防治和检测瑟氏泰勒虫病,降低其发病率是当务之急。为此,本试验建立了一种简便、特异、敏感的瑟氏泰勒虫PCR-ELISA检测方法,为瑟氏泰勒虫病流行病学调查及诊断提供手段。首先根据Genbank上发布的瑟氏泰勒虫基因序列[DQ078264.1]设计两对相同序列引物,并在其中一对引物上下游5’端分别标记上生物素(Biot)及地高辛(Dig),合成一对标有非放射性物引物。从PCR检测为瑟氏泰勒虫病阳性抗凝血中提取基因组DNA,进行常规PCR,获得该病的目的基因片段,纯化回收后,将其克隆到pMD-19T simple载体,进行质粒PCR及双酶切鉴定,确定阳性结果后送往生物公司进行测序,完成基因检测。根据PCR-ELISA方法基本步骤,对链酶亲和素浓度、封闭时间、PCR产物稀释度、HRP-抗地高辛抗体的稀释度及显色时间等进行优化,确定反应的最佳条件。选取40份经PCR检测确定为瑟氏泰勒虫阴性样本进行PCR-ELISA检测,测定OD450nm值,按照公式x+3SD计算瑟氏泰勒虫病PCR-ELISA方法的临界值,确定判定标准。将瑟氏泰勒虫基因组DNA进行倍比稀释,PCR-ELISA方法测定,确定敏感性。以牛弓形虫、新孢子虫、环形泰勒虫等基因组DNA为模板在最佳反应条件下检测该方法的特异性。通过对同一时间包被酶标板的重复性试验和不同时间包被酶标板的重复性实验来检测此种方法的稳定性。取112份待检牛抗凝血进行检测,与常规PCR法进行比较,确定该方法在临床上的应用。结果表明,常规PCR检测后条带大小约为421 bp,与Genbank上发布的瑟氏泰勒虫基因序列[DQ078264.1]的同源性达到99%,证明扩增的目的片段为瑟氏泰勒虫。对各个试验环节进行优化,得出链酶亲和素浓度为5 μg/mL, HRP标记抗地高辛抗体稀释2000倍,封闭时间为60 min, PCR产物稀释30倍,底物显色15 mmin时,为最适的反应条件。检测40份经PCR检测确定为瑟氏泰勒虫阴性样本得出临界值为0.174,样本OD450nm值大于0.174的为瑟氏泰勒虫阳性,反之为阴性PCR-ELISA方法测出瑟氏泰勒虫DNA最低浓度为18fg/μL,较常规PCR法检测出的18fg/μL,敏感性高10倍,且与牛弓形虫、新孢子虫、环形泰勒虫等之间无交叉反应,具有较强的特异性。对112份待检牛抗凝血进行检测,阳性检出率为34.8%,高于常规PCR法的28.6%。本试验建立一种特异、敏感、安全、省时的瑟氏泰勒虫快速检测方法,可适用于瑟氏泰勒虫病的诊断和流行病调查。

关键词：瑟氏泰勒虫 p33基因 PCR—ELISA 建立

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瑟氏泰勒虫与环形泰勒虫某些特性的比较研究

中国兽医科技 1994年第4期24卷 9-11页

作者：刘光远周俊英中国农业科学院兰州兽医研究所

通过长角血蜱和残缘璃眼蜱的交互传递试验、虫体形态学观察及过氧化物酶等同工酶的分析，对瑟氏泰勒虫及环形泰勒虫作了比较研究。结果表明，长角血蜱只能传播瑟氏泰勒虫而不能传播环形泰勒虫；同样，残缘璃眼蜱只能传播环形泰勒虫而不... 详细信息

通过长角血蜱和残缘璃眼蜱的交互传递试验、虫体形态学观察及过氧化物酶等同工酶的分析，对瑟氏泰勒虫及环形泰勒虫作了比较研究。结果表明，长角血蜱只能传播瑟氏泰勒虫而不能传播环形泰勒虫；同样，残缘璃眼蜱只能传播环形泰勒虫而不能传播瑟氏泰勒虫。瑟氏泰勒虫以杆形和梨子形为主，其比例一般保持在６７％～９０％之间；而环形泰勒虫则主要以圆环形和卵圆形为主，占总数的７０％～８５％。经聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析表明，这两个种的过氧化物酶同工酶均有两条带，但瑟氏泰勒虫的迁移速度要比环形泰勒虫的明显的快。

关键词：瑟氏泰勒虫环形泰勒虫同功酶分析

中国黑白花牛瑟氏泰勒虫和卵形巴贝虫混合感染病例

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中国兽医科技 2003年第2期33卷 63-64页

作者：许应天张守发延边大学农学院动物医学系吉林龙井133400

最近，作者在整理以前的血涂片标本时意外地发现了一种血液原虫。根据原始记录、重体形态等特征，综合判定为卵形贝虫（Babesia ovata），该原虫在本地区为首次发现.

关键词：症状形态特征诊疗中国黑白花牛瑟氏泰勒虫卵形巴贝虫混合感染

不同地区牛瑟氏泰勒虫主要抗原32k蛋白编码基因酶谱分型

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畜牧兽医学报 1996年第2期27卷 188-192页

作者：魏强正义石原智明获原克郎高桥清志中国医学科学院实验动物研究所日本酪农学园大学兽医学科

提取日本和澳大利亚等不同地区牛红细胞感染瑟氏泰勒虫的ＤＮＡ，利用其主要表面抗原３２ｋ蛋白编码基因的５’和３’端附近序列合成一对引物，经ＰＣＲ方法扩增出约９００ｂｐ大小的基因片段，连接入ｐＢＲ３２２质粒中，转出入大肠杆... 详细信息

提取日本和澳大利亚等不同地区牛红细胞感染瑟氏泰勒虫的ＤＮＡ，利用其主要表面抗原３２ｋ蛋白编码基因的５’和３’端附近序列合成一对引物，经ＰＣＲ方法扩增出约９００ｂｐ大小的基因片段，连接入ｐＢＲ３２２质粒中，转出入大肠杆菌ＪＭ１０９中，经四环素及氨苄青霉素培养筛选出２０～３０个克隆，再用ＰＣＲ方法扩增出每个克隆的靶基因，经ＨｉｎｄⅢ，ＢｇＩＩ和ＫｐｎⅡ限制性内切酶消化后电泳，可分出１型、２型和３型不同酶谱电泳型，且证明不同地区牛感染此原虫的类型不同。

关键词：瑟氏泰勒虫 PCK 质粒构建限制性内切酶分析