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琼胶糖降解菌的鉴定和选育及其发酵产物的研究

琼胶糖降解菌的鉴定和选育及其发酵产物的研究

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作者：张竹琳南京农业大学

学位级别：硕士

琼胶被公认为是一种安全的食品添加剂。琼胶来源的寡糖包括琼胶寡糖(agaro-oligosaccharides, AOS)和新琼寡糖(neoagaro-oligosaccharides, NAOS),是一类新型的海洋功能性低聚糖。琼胶寡糖的生物活性正在逐渐被挖掘,不仅具有功能性低聚... 详细信息

琼胶被公认为是一种安全的食品添加剂。琼胶来源的寡糖包括琼胶寡糖(agaro-oligosaccharides, AOS)和新琼寡糖(neoagaro-oligosaccharides, NAOS),是一类新型的海洋功能性低聚糖。琼胶寡糖的生物活性正在逐渐被挖掘,不仅具有功能性低聚糖的一般特性,还具有许多普通寡糖无法替代的生理功能特性,如抑菌作用、增殖肠道益生菌作用、抗氧化作用、抗病毒作用、抗炎作用、抗龋齿及抗淀粉老化等多方面生物活性,对黑素瘤细胞有增湿美白作用。因此,琼胶低聚糖在食品、化妆、医药等行业具有很大的潜在应用价值。迄今为止,实现了产业化生产的只有从大西洋假单孢菌(Pseudomonas atlantica)中分离的p-琼胶酶,并且价格昂贵,应用范围也仅限于科研工作,大大阻碍了琼胶酶及琼胶低聚糖的开发应用,因而对琼胶酶的研究具有极其重要的意义。本论文主要对高活性的琼脂糖降解菌的筛选鉴定、琼脂糖降解菌的诱变育种、琼脂糖降解菌发酵条件的优化、假别单胞菌fmb-A18细胞制备琼胶寡糖进行了研究,旨在为琼胶低聚糖的生产和应用奠定基础。主要研究结果分述如下： 1.从海水中分离筛选得到了琼脂糖降解菌并对其进行鉴定。采用人工海水培养基初筛、摇瓶复筛的筛选策略,从连云港近海海水中分离筛选到一株具有琼胶酶活性的菌株fmb-A17,其琼胶酶活为4.5U/mL。通过对其形态特征、生理生化特征进行鉴定,初步判定该菌株为假别单胞菌Pseudoalteromonas。采用细菌16S rDNA序列的通用引物对菌株fmb-A17进行PCR扩增,获得1147bp的片段。将该PCR产物在GenBank数据库中BLAST软件进行同源搜索比对,利用Clustal Ⅹ1.83和MEGA4.0软件进行多重比较后绘制系统发育树,结果表明：菌株fmb-A17的16S rDNA序列与假别单胞菌Pseudoalteromonas sp. BSs20060的16S rDNA序列同源性达99%;在系统发育树中,菌株fmb-A17与P. tunitaca在同一分支,亲缘关系最近。结合常规形态特征、生理生化特征,鉴定该菌株为假别单胞菌Pseudoalteromonas。 2.琼脂糖降解菌fmb-A17的诱变育种。采用了NTG、EMS、LiCl和低能氮离子束注入等四种诱变方法同时对Pseudoaltermonas sp. fmb-A17进行诱变,确定了最佳的诱变条件。结果表明,NTG诱变的最佳浓度是10μg/mL, EMS的最佳浓度是0.07mol/mL, LiCl的最佳浓度是1%,在10kev能量下,选择氮离子注入时间为10s。最终,获得突变株fmb-A18酶活为7.38U/mL,且遗传性状稳定。 3.琼脂糖降解菌突变株fmb-A18的发酵条件优化。先后通过单因素实验、Plackett-Burma设计以及响应曲面设计,确定菌株finb-A18发酵产酶的最佳条件。结果表明：单因素实验的最佳条件为,培养温度28℃、转速180rpm、装液量50mL、接种量10%、发酵时间24h,琼脂粉0.2%、酵母粉0.1%、麦芽糖0.1%、柠檬酸三铵0.1%、MgSO4·7H2O0.5%、KC11mmol/L、K2HPO4100μmol/L、CaCl2100μmol/L、 FeSO4.7H21μmol/L;PB设计筛选得到的发酵培养基的关键因子为酵母粉、麦芽糖和KCl,并确定响应曲面的中心点为：酵母粉0.24%、麦芽糖0.2%、KC11mmol/L;响应曲面法设计确定了最终培养基的最优组合为麦芽糖1.706g/L、酵母粉1.174g/L、 KC11.021mmol/L、NaCl40g/L、FeSO40.5pmol/L、K2HPO4100μmol/L、柠檬酸三铵1g/L、MgSO45g/L、琼脂粉2.4g/L,在此发酵条件下,菌株fmb-A18发酵上清的酶活可达到15.044U/mL,比原始培养条件提高了103.85%。 4.假别单胞菌finb-A18细胞制备琼胶寡糖。通过对琼脂糖、酵母粉、柠檬酸三铵、MgSO4、NaCk、发酵时间等因素对Pseudoalteromonas sp. fmb-A18细胞转化法生产琼胶寡糖的影响进行了考察和分析,其发酵上清液经离心除菌,75%乙醇沉淀,通过大孔树脂NAK-II静态及动态吸附、DEAE-Sephcel阴离子交换层析、HiTrapTM esalting脱盐层析和Sephadex G15葡聚糖凝胶层析,获得HPLC为单一峰的琼胶寡糖,并对其进行了鉴定。结果表明：由单因素实验获得的Pseudoalteromonas sp. fmb-A18细胞转化法生产琼胶寡糖的反应最佳体系为,琼脂糖浓度为0.4%、酵母粉浓度为20g/L、柠檬酸三铵浓度为8g/L、MgSO4的

关键词：琼脂糖琼脂糖降解菌假别单胞菌发酵优化制备

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