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东莞地区痤疮患者痤疮丙酸杆菌耐药基因分析

东莞地区痤疮患者痤疮丙酸杆菌耐药基因分析

作者：唐慧菁暨南大学

学位级别：硕士

【目的】痤疮是一种慢性炎症性毛囊皮脂腺疾病,好发于青春期,流行病学报道显示,痤疮患病率为60%-90%。痤疮丙酸杆菌(Corynebacterium acnes,***)是痤疮发病的一个重要因素,使用抗生素治疗痤疮成为治疗的主要手段之一,但由此又产生了耐... 详细信息

【目的】痤疮是一种慢性炎症性毛囊皮脂腺疾病,好发于青春期,流行病学报道显示,痤疮患病率为60%-90%。痤疮丙酸杆菌(Corynebacterium acnes,***)是痤疮发病的一个重要因素,使用抗生素治疗痤疮成为治疗的主要手段之一,但由此又产生了耐药。本研究旨在通过收集门诊痤疮患者,分离并培养痤疮丙酸杆菌临床株,体外进行临床上常用的11种抗生素药敏性试验,根据药敏结果挑选临床耐药菌株和临床敏感菌株进行高通量基因测序,并与标准株痤疮丙酸杆菌ATCC 6919进行对照,了解本地区痤疮患者痤疮丙酸杆菌耐药基因的情况,从耐药分子机制层面为临床医师用药提供理论依据。【方法】收集符合研究标准的痤疮患者212例,采集、分离痤疮丙酸杆菌,厌氧条件下培养,依靠革兰染色及显微镜初步鉴定细菌形态,使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术进行菌种鉴定并在体外进行药敏试验。通过琼脂稀释法检测临床分离菌株对大环内酯类、林可酰胺类、四环素类、头孢类、喹诺酮类、硝基咪唑类及磺胺类的最低抑菌浓度,根据药敏及鉴定结果选取大环内酯类-林可酰胺类抗生素高度交叉耐药菌株和敏感菌株共57株,采用十六烷基三甲基溴化铵法(Cetyltrimethylammonium Ammonium Bromide,CTAB)法提取DNA和琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,随后上机建库进行全基因鸟枪法(WGS)高通量重测序;痤疮丙酸杆菌标准株ATCC 6919采用二代测序Illuminate+三代测序Pac Bio RSII进行全基因组测序。实验数据组装由SMRT Analysis(HGAP3)完成。【结果】1.212例痤疮患者共分离痤疮丙酸杆菌156株,体外药敏结果显示:11种抗生素中除了四环素、多西环素、米诺环素和头孢曲松钠100%敏感以及甲硝唑和复方新诺明100%天然耐药之外,剩余5种抗生素(红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、克林霉素、左氧氟沙星)均存在着不同程度多重、交叉耐药。耐药情况如下:克拉霉素84.0%(131/156)、阿奇霉素48.7%(76/156)、红霉素30.1%(47/156)、克林霉素28.9%(45/156)、左氧氟沙星5.1%(8/156),其中二重耐药19.4%,三重耐药5.7%,四重耐药28.1%,五重耐药4.3%。2.痤疮丙酸杆菌ATCC 6919(ID:CP023676)的完整基因组由长2,495,001个碱基对的单个环状染色体组成(1个重叠群,N50为13023),GC含量为60.02%,它包含2,450个基因,我们预测和注释了2,437个推定基因,测序深度是100x。我们在CARD数据库中发现ATCC 6919携带thy A抗性基因(ID:08890)。3.57株重测序菌株中,4株敏感株,7株仅对克拉霉素低、中度耐药,6株仅对阿奇霉素低、高度耐药,剩余40株为多重耐药菌株。40株多重耐药菌株中,25%(10/40)在23Sr RNA基因片段2058位点发现由A→G突变,5%(2/40)在23Sr RNA基因片段2058位点发现由A→T突变;65%(26/40)通过CARD和ARDB数据库注释erm X耐药基因阳性;5%(2/40)的高度多重耐药菌未发现携带耐药基因和突变位点。携带erm X耐药基因样品与23Sr RNA基因2058位点发生突变的样品不存在交叉重叠。此外,在40株多重、交叉耐药的痤疮丙酸杆菌中,6株菌株显示五重耐药,83.3%(5/6)通过CARD和ARDB数据库注释gry A耐药基因阳性。【结论】本研究为国内率先采用第二代测序技术对痤疮丙酸杆菌耐药基因进行检测,并对20世纪60年代痤疮丙酸杆菌ATCC 6919进行第二代和第三代全基因测序,测序结果已上传NCBI数据库。本研究标本量较大共57株痤疮丙酸杆菌,采用第二代测序技术检测,耐药结果显示:发现65%多重耐药菌株携带erm X耐药基因,30%在23Sr RNA片段2058位点发现A-G或A-T突变,5%的多重耐药菌株存在未知耐药机制,该耐药机制分配比例符合临床痤疮丙酸杆菌对大环内酯-林可酰胺类抗生素广泛耐药的临床表现。

关键词：痤疮丙酸杆菌琼脂稀释法高通量测序耐药基因

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究

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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学研究

作者：叶涛华中科技大学

学位级别：硕士

目的:分析湖北地区耐甲氧西林金葡菌（ Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的分布特点及其对临床常用抗菌药物的敏感性,研究不同医院MRSA的同源性,初步了解本地区MRSA分子流行病学特征,为耐药株的预防、临床治疗及减... 详细信息

目的:分析湖北地区耐甲氧西林金葡菌（ Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的分布特点及其对临床常用抗菌药物的敏感性,研究不同医院MRSA的同源性,初步了解本地区MRSA分子流行病学特征,为耐药株的预防、临床治疗及减少克隆株传播提供依据。方法:收集2007年10月至2008年1月湖北地区16家医院金黄色葡萄球菌293株,采用琼脂稀释法测定其对15种临床常用抗菌药物最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）;提取细菌基因组DNA,采用随机引物扩增PCR（RAPD）对75株MRSA进行同源性分析;多重PCR技术扩增SCCmec基因进行分型,同时检测PVL基因。结果:1.共收集金黄色葡萄球菌293株,其中MRSA占51.2%（150/293）,它对青霉素、红霉素的耐药率均在70%以上,未发现万古霉素、替考拉宁、夫西地酸不敏感菌株,主要耐药模式为庆大霉素、左氧氟沙星、红霉素、利福平和克林霉素同时耐药,占MRSA的46.7%（70/150）;2.采用RAPD可以将75株MRSA分成25个基因型。3.75株MRSA的SCCmec分型中Ⅲ型67株,Ⅲa型6株,Ⅳ型2株。2株MRSA检测PVL阳性。结论:湖北地区金黄色葡萄球菌耐药状况严重,尤其是多重耐药金黄色葡萄球菌检出率很高,未发现对万古霉素、替考拉宁、夫西地酸不敏感的菌株。RAPD具有快速、灵敏、可靠的特点,有利于MRSA感染监控的筛选。本地区MRSA主要为Ⅲ型SCCmec,PVL检出率较低,与菌株主要为医院相关菌株有关。

关键词： MRSA 琼脂稀释法 RAPD分型 SCCmec分型分子流行病学 PVL

中药水提物对痤疮丙酸杆菌体外抑制作用及对兔耳痤疮模型的疗效研究

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中药水提物对痤疮丙酸杆菌体外抑制作用及对兔耳痤疮模型的疗效研...

作者：廖恒利泸州医学院

学位级别：硕士

目的：分别提取十九种中药的水提物，观察其对痤疮丙酸杆菌标准株及临床株的体外抑制作用，从中筛选出对痤疮丙酸杆菌具有体外抑制作用的中药水提物，并将筛选出的药物外用于兔耳痤疮模型进行疗效及不良反应观察，从而为今后临床上痤疮... 详细信息

目的：分别提取十九种中药的水提物，观察其对痤疮丙酸杆菌标准株及临床株的体外抑制作用，从中筛选出对痤疮丙酸杆菌具有体外抑制作用的中药水提物，并将筛选出的药物外用于兔耳痤疮模型进行疗效及不良反应观察，从而为今后临床上痤疮的治疗提供一些新的可供选择的药物。方法：1．采集痤疮患者皮损内容物，37°C厌氧培养48小时后，采用耐氧实验、革兰氏染色镜检、触媒实验、硝酸盐实验、糖发酵实验等系列生化实验以及ANI厌氧菌鉴定卡，VITEK全自动微生物鉴定仪鉴定为痤疮丙酸杆菌。2．经查阅文献[3-4]后选择临床上使用频率较高的19种中药（黄柏、黄芩、大黄、金银花、苦参、连翘、地肤子、白头翁、百花蛇舌草、鱼腥草、马齿苋、旱莲草、紫草、板蓝根、大青叶、蒲公英、车前子、白芷、蛇床子）各20g，分别加水浸泡、煎煮、过滤、浓缩配制成20ml(相当于原药浓度1g/ml)的中药水提物。3．配制含不同浓度的19种中药水提物的改良GAM培养平板，以琼脂稀释法检测各种药物的MIC，筛选出对痤疮丙酸杆菌有体外抑菌作用的中药水提物;同时检测临床上治疗痤疮常用的4种抗生素的MIC，以了解痤疮丙酸杆菌的耐药情况。4．选取健康雄性家兔（普通级）7只，采用Kligman法造模，将煤焦油外涂于兔耳的双侧耳管开口2cm×2cm处，每日1次，连续2周，于造模第7天时皮下注射痤疮丙酸杆菌菌悬液，浓度为1.0×108CFU/ml，每侧约50ul。造模成功后以随机分组方式将14只兔耳分为7组，每组2只，其中6组擦拭中药水提物，第7组1只兔耳擦拭夫西地酸乳膏，另1只擦拭生理盐水进行对照，每日1次，分别于第7天、第14天、第21天观察其疗效及不良反应。结果：1．从80例痤疮患者皮损处分离培养并鉴定出痤疮丙酸杆菌27例，阳性率为33.75%，性别、年龄无统计学差异。2．黄柏、黄芩、大黄的MIC为25mg/ml;金银花、苦参的MIC为50mg/ml;连翘的MIC为100mg/ml;地肤子、白头翁、百花蛇舌草、鱼腥草、马齿苋、旱莲草、紫草、板蓝根、大青叶、蒲公英、车前子、白芷、蛇床子13味中药在最高浓度200mg/ml进行测试时仍未产生抑菌作用。3．甲硝唑MIC50为16μg/ml，MIC90为128μg/ml，耐药率为78.57%。克林霉素MIC50为4μg/ml， MIC90为16μg/ml，耐药率为28.57%。阿奇霉素MIC50为2μg/ml，MIC90为8μg/ml，耐药率为21.42%。罗红霉素MIC50为1μg/ml，MIC90为64μg/ml，耐药率为46.42%。4．兔耳在涂煤焦油7天后，局部增厚，变硬，毛孔变粗大，毛囊口增大并开放隆起，可见白色粉刺及黑色角栓。第14天时可见红色炎性丘疹及少许脓疱。5．经分别擦拭黄柏、黄芩、大黄、金银花、苦参、连翘六种中药水提物治疗7天后的兔耳红肿减轻，部分消退，14天后兔耳厚度变薄，柔软度有所增加，21天后局部毛囊口角栓及丘疹、粉刺减少变平。未见红斑、脱屑等不良反应;外用夫西地酸乳膏治疗后的兔耳红肿消退，而擦拭生理盐水的兔耳与治疗前相比未见明显变化。结论：1．黄柏、黄芩、大黄、金银花、连翘、苦参六种中药水提物对痤疮丙酸杆菌具有良好的体外抑制作用。2．痤疮丙酸杆菌对甲硝唑、克林霉素、罗红霉素、阿奇霉素四种抗生素均有不同程度的耐药，其中甲硝唑耐药率最高。3.黄柏、黄芩、大黄、金银花、连翘、苦参六种中药水提物对实验兔耳痤疮模型有治疗作用。4．外用黄柏、黄芩、大黄、金银花、连翘、苦参六种中药水提物治疗兔耳痤疮模型未观察到明显的不良反应。

关键词：痤疮丙酸杆菌中药水提物琼脂稀释法痤疮模型

中国O139群霍乱弧菌药物敏感性分析和耐药机制研究

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中国O139群霍乱弧菌药物敏感性分析和耐药机制研究

作者：于礼山东大学

学位级别：硕士

目的抗生素的广泛使用甚至滥用使得细菌面临异常的选择压力,而这种选择压力促使细菌通过各种机制获得耐药性,如基因突变和耐药基因的水平传递,从而使细菌对各类抗生素均可产生耐药,尤其最近关于细菌多重耐药的报道越来越多。0139群霍乱... 详细信息

目的抗生素的广泛使用甚至滥用使得细菌面临异常的选择压力,而这种选择压力促使细菌通过各种机制获得耐药性,如基因突变和耐药基因的水平传递,从而使细菌对各类抗生素均可产生耐药,尤其最近关于细菌多重耐药的报道越来越多。0139群霍乱弧菌是霍乱中的新病原体,1992年出现以来,在东南亚以及我国引起流行,并常导致聚餐暴发。为了解我国0139群霍乱弧菌的耐药性状况,为指导临床合理用药提供依据,本研究对我国0139群霍乱弧菌出现流行以来的分离株选择300株进行了药物敏感性检测,以了解我国0139群霍乱弧菌的耐药状况和耐药谱变化,并进一步从耐药基因水平传递和基因突变两个方面对耐药机制进行研究。方法根据美国临床实验室标准化研究所CLSI标准中建议临床微生物学实验室对霍乱弧菌和肠杆菌科常规药敏试验时应考虑的抗生素,选取各类药物中有代表性的17种抗生素,采用WHO推荐的琼脂稀释法和微量肉汤稀释法,对我国1993年-2007年间分离到的0139群霍乱弧菌选择300株进行药物敏感性试验,质控菌株为ATCC25922和ATCC29213。通过GenBank搜索1—4类整合子和SXT接合性转移元件的基因序列,分别在各自特异性整合酶保守区设计引物,通过PCR扩增检测相应水平传递和耐药基因在霍乱弧菌中的分布情况,评价其在细菌耐药性方面发挥的作用。通过GenBank搜索霍乱弧菌拓扑异构酶编码基因gyrA、gyrB、parC和parE序列,在喹诺酮类药物耐药相关决定区设计引物,对215株萘叮酸耐药菌株进行PCR扩增后序列测定,分析耐药菌株在这些基因变中的序列突变特征。结果300株0139群霍乱弧菌对三代头孢曲松和头孢克肟均敏感,敏感率达到100%,对头孢呋辛、头孢噻吩、强力霉素和环丙沙星也大部分敏感,敏感率分别为99.3%、83.3%、91.3%和95.0%,对阿奇霉素、呋喃托因的敏感率分别为65.3%、53.3%,而超过半数的霍乱弧菌对氯霉素、卡那霉素、萘啶酸、四环素、氨苄西林和复方新诺明耐药,敏感率分别只有39.0%、31.0%、27.3%、27.0%、25.3%和17.0%,大部分0139群霍乱弧菌对链霉素、红霉素和多粘菌素B耐药或者中度耐药,敏感率分别只有1.0%、6.0%和3.3%。99.0%的0139群霍乱弧菌对2种以上的抗生素耐药,47.0%的菌株表现出相同多重耐药谱,即对氨苄西林、复方新诺明、链霉素、氯霉素、萘啶酸、四环素、红霉素和卡那霉素这8种抗生素耐药。O139群霍乱弧菌对氨苄西林、萘啶酸、四环素、氯霉素和卡那霉素的耐药性随年代逐渐升高,并在1998后稳定于较高水平。产CT毒素组霍乱弧菌对萘啶酸、复方新诺明、四环素、氯霉素、阿奇霉素、卡那霉素等8种抗生素的耐药率明显高于非产毒组。整合子检测结果显示,64.3%的0139群霍乱弧菌中存在1类整合子,这些菌株中没有未发现2类和3类整合子,100%的菌株存在4类整合子。霍乱弧菌1类整合子阳性菌株中90.6%的可变区只有一个耐药基因,插入基因盒以aadA(氨基糖苷类耐药相关)基因家族为主,7.8%菌株的可变区含dfrA12(甲氧苄氨嘧啶耐药相关)、orfF(功能未知)和aadA2共3个基因,另外还有2株菌含2个耐药基因arr-2(利福平耐药相关)和aadA3C,1株菌含3个耐药基因arr-3,dfrA27和aadA16。 215株萘啶酸耐药菌株拓扑异构酶耐药决定区测序结果显示:95.3%的菌株都存在两个位点突变,即gyrA第248位碱基突变导致第83位氨基酸由丝氨酸变为异亮氨酸,parC第254位碱基点突变导致第85位氨基酸由丝氨酸Ser变为亮氨酸。8株环丙沙星耐药菌株中6株分离于2001年,在1998年和2006年各分离一株,除上述两个位点突变外,GyrA第87位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺,另外其中7株菌Pare第420位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺,还有1株环丙沙星耐药菌ParE第439位氨基酸由脯氨酸变为丝氨酸。结论0139群霍乱弧菌对抗生素的耐药性呈上升趋势,并在1998年后形成对氨苄西林、复方新诺明、链霉素、氯霉素、萘啶酸、四环素、红霉素和卡那霉素8种抗生素耐药的优势多重耐药谱,目前推荐使用的第二代喹诺酮类药物环丙沙星耐药率低,但已经开始出现耐药株。1、4类整合子和SXT在0139霍乱弧菌中分布广泛,这三种基因元件均具有获得外源性耐药基因的能力,在细菌耐药性方面发挥重要作用。0139群霍乱弧菌中拓扑异构酶Ⅱ及Ⅳ编码基因gyrA和parC突变较普遍,多为点突变,gyrB和parE突变较少,大部分菌株都存在GyrA第83位和ParC第85位氨基酸取代,GyrA第87位氨基酸替换对喹诺酮类耐药性具有重要作用,ParE第420位氨基酸取代在霍乱弧菌中第一次报道。本研究提示了针对霍乱弧菌加强药物

关键词：霍乱弧菌琼脂稀释法整合子喹诺酮类药物拓扑异构酶

茶多酚联用奥硝唑对牙周可疑致病菌的体外抑菌活性研究

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茶多酚联用奥硝唑对牙周可疑致病菌的体外抑菌活性研究

作者：杨暤重庆医科大学

学位级别：硕士

背景牙周病是人类最常见的口腔感染性疾病，在我国发病率呈不断上升趋势，高达70%以上，已成为牙列缺损和牙列缺失的首要原因。目前认为牙周病发病的主导因素为细菌感染及其引发的宿主免疫反应，始动因子则是菌斑中的微生物及其产物。... 详细信息

背景牙周病是人类最常见的口腔感染性疾病，在我国发病率呈不断上升趋势，高达70%以上，已成为牙列缺损和牙列缺失的首要原因。目前认为牙周病发病的主导因素为细菌感染及其引发的宿主免疫反应，始动因子则是菌斑中的微生物及其产物。研究表明牙周可疑致病菌主要包括卟啉单胞菌属（Porphyromonas）、放线杆菌属（Actinomyces）、梭杆菌属（Fusobacterium）、普雷沃菌属（Prevotella）等，此类致病菌一方面通过细菌本身及其毒性产物对牙周组织产生直接破坏，即直接致病作用;另一方面为间接致病作用，主要通过引发宿主的炎性反应和免疫反应，间接影响牙周组织重建。目前认为：治疗牙周病的关键点包括清除致病因子和阻断牙周病的发展，治疗的首选方法为牙周机械治疗。除此之外，药物治疗作为机械治疗的重要辅助手段，在抑制或杀灭致病微生物，调节宿主防御功能，阻断疾病发生和发展，促进组织愈合等方面显示出越来越重要的作用。由于牙周病是多种因子共同作用，多种细菌共同参与的感染性疾病，单独使用一种抗厌氧菌药物无法达到预期疗效，两种抗菌药物联合使用的方法成为牙周药物治疗的主流。因此，寻求一种有效可行的抗菌药联用方案成为牙周病治疗领域的研究热点。茶多酚（Tea polyphenols，TP）是指一类从绿茶中提取而出的结构复杂的混合物，其主要成分包括儿茶素、花色素、黄酮醇、酚酸及其缩酚酸等多酚类化合物。其对牙周主要致病菌有着较强的抗菌活性，其主要功能除具有抗菌作用外，还具有抗变态反应、清除自由基，促进牙周组织重建的作用。奥硝唑（ornidazole,ONZ）是第三代硝基咪唑类抗菌药物，它比第一代该类药物甲硝唑和第二代产品替硝唑的抗厌氧菌作用更强且副作用更轻。目前已有较多文献报道将奥硝唑与其他抗菌药物联合使用的情况，但奥硝唑与中药提取物联用治疗牙周病的报道相对较少。目的本研究选取6种常见的中药提取物和奥硝唑对9种牙周可疑致病菌进行体外药敏实验，为选择抗菌药物提供理论支持。再通过配伍稳定性实验和配伍药敏实验探讨茶多酚和奥硝唑联合使用的可行性,为两种药物的配伍使用提供依据。材料和方法1.实验药物的体外抗菌活性采用厌氧菌药物敏感实验琼脂稀释法，分别检测六种中药提取物（茶多酚、厚朴酚、黄芩甙、大黄素、五倍子提取物和黄连素）以及奥硝唑对9种牙周可疑致病菌：即牙龈卟啉单胞菌（Porphynomonas gingivalis）ATCC33277和381、牙髓卟啉单胞菌（Porphyromonas endodentalis）ATCC34506、中间普雷沃菌（Prevotella intermedius）ATCC25611、人体普雷沃菌（Prevotellacorporis）ATCC33547、具核梭杆菌（Fusobacteriumnucleatum）ATCC25586、多形拟杆菌（Bacteriodes thetaiotaomicron）CDC1041-A、龋齿放线菌（Actinomyces odontolyticus）ATCC17929、粘性放线菌（Actinomycesviscosus）ATCC15987的MIC和MBC。 2.实验药物配伍试验：通过肉眼观察和测量pH值的变化情况来检测茶多酚和奥硝唑联用后的理化变化，然后使用紫外分光光度仪采用酒石酸亚铁比色法观测茶多酚联用奥硝唑吸收值及吸收曲线的变化情况，以此判断有无新物质生成。 3.实验药物联用的相关性评价：通过琼脂棋盘稀释法，采用FIC值为指标，分别检测茶多酚联用奥硝唑对牙龈卟啉单胞菌ATCC33277和381、牙髓卟啉单胞菌ATCC34506、中间普雷沃菌ATCC25611、具核梭杆菌ATCC25586等7种细菌抑菌作用的相互关系。结果1.通过琼脂稀释法发现：奥硝唑对9种供试菌的抗菌活性较佳。六种中药提取物中，茶多酚对9种供试菌的MBC和MIC值较低，提示茶多酚对9种实验细菌较其他5种中药提取物有着更强的抑菌能力;其次为厚朴酚和五倍子提取物，而大黄素、黄连素和黄芩甙相对较差。 2.茶多酚和奥硝唑供试液混合后，测得混合液在0,1,2,3,4h时点外观和pH值无明显变化，且紫外分光光度仪测得其吸收值和吸收曲线基本相同。 3.通过琼脂棋盘稀释法测得茶多酚联用奥硝唑对供试菌FIC值为0.508～1.000。结论（1）在六种中药提取物之中，茶多酚对9种牙周病原菌均有一定的抗菌活性，奥硝唑对该类厌氧菌抗菌效果更佳。（2）茶多酚和奥硝唑无配伍禁忌。（3）对牙周可疑致病菌而言，茶多酚和奥硝唑联用的抗菌效果为相加作用。

关键词：茶多酚奥硝唑琼脂稀释法琼脂棋盘稀释法

重庆地区痤疮丙酸杆菌对四种抗生素耐药性的调查

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重庆地区痤疮丙酸杆菌对四种抗生素耐药性的调查

作者：刘丽华重庆医科大学

学位级别：硕士

目的痤疮丙酸杆菌(***)是痤疮的重要致病菌,在当前各种新型广谱抗生素选择压力下不断呈现新的流行趋势和耐药特征。通过测定红霉素、克林霉素、四环素、甲硝唑对***的最低抑菌浓度,了解P. acnes对四种抗生素的耐药现状及耐药性变化的动... 详细信息

目的痤疮丙酸杆菌(***)是痤疮的重要致病菌,在当前各种新型广谱抗生素选择压力下不断呈现新的流行趋势和耐药特征。通过测定红霉素、克林霉素、四环素、甲硝唑对***的最低抑菌浓度,了解P. acnes对四种抗生素的耐药现状及耐药性变化的动态,旨在为临床治疗提供用药参考。方法本研究主要从以下方面进行了一些探索。第一:收集60例痤疮患者的痤疮内容物作为标本,进行分离培养,将获得的菌株进行菌落形态、镜下形态、触酶试验、硝酸盐试验和吲哚试验的鉴定后,再予VITEK全自动微生物分析系统、ANI厌氧菌鉴定卡鉴定;第二:用卡方检验比较不同性别及年龄组中***的培养阳性率是否有显著差异;第三:用琼脂稀释法检测***对红霉素、克林霉素、四环素、甲硝唑的敏感水平。结果本研究60份标本中,分离培养出33株***,均经过菌落形态、镜下形态、触酶试验、硝酸盐试验和吲哚试验和VITEK全自动微生物分析系统、ANI厌氧菌鉴定卡鉴定鉴定明确。其中菌落形态、镜下形态、触酶试验、硝酸盐试验和吲哚试验得到结果与VITEK全自动微生物分析系统、ANI厌氧菌鉴定卡鉴定相一致。本实验中***分离阳性率为55%,其分离阳性率与性别及年龄无关。将这33株***用琼脂稀释法检测其对四种抗生素的敏感水平。测定结果显示33株***中对红霉素耐药的有19株,对甲硝唑耐药的有13株,对四环素耐药的有5株,对克林霉素耐药的有3株,其耐药率分别为57.6%、39.4%、15.2%、9.1%。结论重庆地区的***存在着耐药情况,尤其对红霉素的耐药率较高。P. acnes耐药性的产生与抗生素的不合理应用有关,临床皮肤科应掌握病原菌流行趋势和耐药特征,这对于控制耐药菌株的流行和蔓延,指导临床合理使用抗生素有着十分重要的意义。

关键词：痤疮丙酸杆菌琼脂稀释法抗生素耐药性

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中药桂皮醛对口腔致龋菌的体外抑菌活性研究

重庆医科大学学报 2009年第10期34卷 1409-1410页

作者：杨霞黄萍李丛华重庆医科大学附属口腔医院口腔内科教研室重庆400015 四川大学华西口腔医学院牙周科成都610041

目的:探讨桂皮醛对主要致龋菌的抗菌活性。方法:采用琼脂稀法药敏敏感试验,测定桂皮醛对主要致龋菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitive concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimal bacterecdal concentration,MBC)。结果:桂皮醛能明显... 详细信息

目的:探讨桂皮醛对主要致龋菌的抗菌活性。方法:采用琼脂稀法药敏敏感试验,测定桂皮醛对主要致龋菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitive concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimal bacterecdal concentration,MBC)。结果:桂皮醛能明显抑制分离的50株临床株,其MIC值在(32～256)mg/L之间,微荣球菌(***)的平均最低抑菌浓度为(139.000±0.026)mg/L;丙酸杆菌(***)的平均最低抑菌浓度为(128.000±0.000)mg/L;颊纤毛菌(***)的平均最低抑菌浓度为(213.000±0.027)mg/L;变形链球菌(***)的平均最低抑菌浓度为(213.00±0.021)mg/L;粘性放线菌(***)的平均最低抑菌浓度为(148.00±0.021)mg/L。

关键词：致龋菌桂皮醛琼脂稀释法 MIC

鹿藿正丁醇提取物的体外杀精作用及机制初步探讨

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鹿藿正丁醇提取物的体外杀精作用及机制初步探讨

作者：黄世兴华中科技大学

学位级别：硕士

目的实验研究鹿藿正丁醇提取物(n-Butanol extract of Rhynchosia volubilis Lour，BERVL)体外杀精子作用。方法室温下，将50μl正常新鲜精液与200μl不同浓度BERVL混匀。立即显微镜下观测BERVL与人精液混合后精子活动能力的变化。连... 详细信息

目的实验研究鹿藿正丁醇提取物(n-Butanol extract of Rhynchosia volubilis Lour，BERVL)体外杀精子作用。方法室温下，将50μl正常新鲜精液与200μl不同浓度BERVL混匀。立即显微镜下观测BERVL与人精液混合后精子活动能力的变化。连续观察5个高倍镜视野，至少计数200个精子，2min内计算有活动能力的精子百分率。结果BERVL直接作用于人精子后2min内，250mg/ml浓度组，显微镜下未见任何有活动能力精子;125mg/ml浓度组，仅(2.34±1.38)%的精子存在原地活动能力;100mg/ml浓度组，约(2.41±1.19)%的精子存在原地活动能力;90mg/ml浓度组，有(4.73±3.23)%的精子尚存在原地活动能力;62.5mg/ml浓度组，约(36.72±19.87)%的精子存在原地和前向活动能力。结论BERVL具有较好的体外杀精子作用。不同浓度的杀精子作用不同，90mg/ml的BERVL与人精液混合后，2min内未见任何前向活动的精子，提示90mg/ml可能是最为理想的体外杀精子浓度。目的研究BERVL体外对嗜酸乳酸杆菌的影响，初步评估BERVL作为外用避孕药的可能性。方法琼脂稀释法：选取直径为60mm的培养皿，将制备好的嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854单细菌悬液100μl与200μl不同浓度的BERVL混匀，加入适量MRS琼脂，放置37℃孵育箱孵育18h4h后观察菌落生长情况;试管稀释法：选取15ml的有盖试管，编号并加入4800μl MRS培养液，将200μl不同浓度BERVL药液的和嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854单细菌悬液100μl加入试管，充分混匀后，放置37℃孵育箱孵育18-24h后观察抑菌情况。结果不同浓度的BERVL对嗜酸乳杆菌存在不同程度的抑制作用。琼脂稀释法：500,250,125,100,90及62.5mg/ml浓度组，被抑制生长的嗜酸乳杆菌百分率分别为：100%,89.15%,47.99%,40.97%和32.96%;试管稀释法：500,250,125,100,90及62.5mg/ml浓度组，被抑制生长的嗜酸乳杆菌百分率分别为：100%,100%,50%,45.54%,35.7%和21.4%。结论无论是试管稀释法还是琼脂稀释法结果都显示BERVL对嗜酸乳杆菌CGMCC1.1854存在抑制作用，且存在明显的剂量相关性。大多植物提取物的抗生育作用都是通过与精细胞脂蛋白膜相互作用，而起到抑制及杀伤精子作用。精子凋亡是可以发生在精子生成、成熟及体外环境过程中的重要现象。因此，本部分通过伊红Y水试验检测BERVL对精子膜功能的影响和免疫荧光染色检测BERVL对精子凋亡的影响，初步探讨其体外杀作用机制。实验一伊红Y水试验目的通过检测BERVL直接作用于人精子后，对精子膜的影响，来探讨BERVL体外杀精子作用机制。方法将200μl浓度为125,100及90mg/ml的BERVL药液分别与10份不同精液标本50μl混匀，然后将精液与伊红Y水溶液按1:1混匀后，取一滴于载玻片上，盖上盖玻片，连续观测5高倍镜视野，至少计数200个精子，观测精子的头部染色及尾部肿胀情况，并计算精子头部未着色百分率和尾部肿胀百分率。结果生理盐水对照组，125,100及90mg/ml浓度组，精子头部未着色百分率分别为(81.44±5.71)%,(6.24±3.31)%,(5.21±3.91)%和(7.85±4.71)%;精子尾部肿胀百分率为(97.50±10.13)%,(83.49±7.05)%,(93.96±6.62)和(92.74±9.43)%。结论BERVL体外直接作用于人精子时，精子头部未着色百分率和尾部肿胀百分率都较对照组低(P＜0.05)，表明BERVL对精子膜有较强的破坏作用。精子头部未着色百分率下降程度显著高于精子尾部肿胀百分率(P＜0.05)，表明BERVL对精子头膜的作用较强，能快速破坏精子头膜，致精子死亡。实验二Hochst33342/PI双染精子凋亡的检测目的通过检测BERVL与精子混合后，对精子凋亡的影响，探讨BERVL体外杀精子作用机制。方法将200μl浓度为125、100及90mg/ml的BERVL药液分别与10份不同精液标本50μl混匀。将含有BERVL药液的精子悬液与Hochst33342/PI按1:1混匀，避光染色3-5min后，荧光显微镜紫外光激发下观测精子染色后情况，正常精子呈淡蓝色，核圆形，早中期凋亡精子呈亮蓝色，核分叶或碎裂;晚期凋亡及死精子呈红色。并计算正常精子百分率、早中期凋亡精子百分率和晚期凋亡及死亡精子率。结果生理盐水对照组,125mg/ml,100mg/ml及90mg/ml浓度组，正常精子百

关键词： BERVL 体外杀精活动精子百分率乳酸杆菌试管稀释法琼脂稀释法精子膜伊红Y水试验头部未着色百分率尾肿胀百分率 Hochst33342/PI 双染精子凋亡精子死亡

耐氨基糖苷类铜绿假单胞菌的分子耐药机制研究

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耐氨基糖苷类铜绿假单胞菌的分子耐药机制研究

作者：黄靖宇广州医学院

学位级别：硕士

铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa, Pae)是院内感染的主要病原菌之一。在中国重症监护病房分离的革兰阴性菌中,铜绿假单胞菌位列第一。由于具有天然和获得性耐药,铜绿假单胞菌对很多抗菌药物耐药,给临床治疗带来很大困难。β-内酰... 详细信息

铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa, Pae)是院内感染的主要病原菌之一。在中国重症监护病房分离的革兰阴性菌中,铜绿假单胞菌位列第一。由于具有天然和获得性耐药,铜绿假单胞菌对很多抗菌药物耐药,给临床治疗带来很大困难。β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物是临床治疗Pae感染的常用药,近年来随着新的耐药基因的不断出现,Pae对这三类抗菌药物的耐药性普遍增加,甚至出现多药耐药(MDR)和泛耐药(PDR)菌株。因氨基糖苷类抗生素抗菌谱广、疗效卓越,在医学临床和畜牧兽医业应用广泛,但由于滥用和过度使用氨基糖苷类药物的耐药问题随之凸现,细菌对该类药物耐药是因为细菌产生氨基糖苷类修饰酶(AMEs)、16SrRNA甲基化酶和氨基糖苷类抗生素作用靶位16S rRNA基因突变而致。氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)三类,分别修饰氨基糖苷药物相应位置上的- OH和- NH2 ,降低或丧失其对靶位核糖体的亲和力。编码AMEs的基因起源于抗生素产生菌,该类基因所表达的酶在抗生素产生菌中起到自我保护作用,许多研究表明抗药性产生菌所存在的自我保护机制与临床耐药菌的耐药机制相同。整合子是一个能够通过自身编码的整合酶来获取保外游离基因或基因片段并使之表达的遗传元件系统。整合子既可位于细菌染色体上,又可位于质粒上,还可位于转座子上。对细菌抗生素耐药机制的研究,导致了包括转座子和共轭质粒在内的许多移动元件的发现,而通过对这些元件序列进行比较分析后,最终发现了整合子的存在。研究目的铜绿假单胞菌是院内感染的主要条件致病菌之一,可引起严重的院内获得性感染。本研究试图了解临床常用的七种抗生素对60株铜绿假单胞菌(30株分离自门诊病人,30株分离自住院病人)的抗菌活性和多黏菌素B与其它六种抗菌药物(庆大霉素、奈替米星、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、亚胺培南)体外联合抗菌效应,以及各种抗菌药物对不同标本来源菌株的抗菌效应有无差别;了解氨基糖苷类耐药相关基因和16SrRNA甲基化酶基因存在情况以及菌株之间的亲缘性;另外通过对临床分离的铜绿假单胞菌的耐药特征进行分析、检测相关耐药基因和整合子携带情况等,初步探讨铜绿假单胞菌对临床常用抗菌药物的分子耐药机制,从而了解不同的耐药机制间相互作用规律以及耐药基因在菌株间水平传播的特点,为临床用药提供实验室依据和帮助。研究方法 1、药敏试验和联合药敏试验 60株铜绿假单胞菌均来自广州医学院第一附属医院的临床标本,对这些菌株采用琼脂稀释法测定7种临床常用抗生素的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和药敏情况,分析铜绿假单胞菌对这些抗生素的药物敏感性;同时检测多粘菌素B与其它6种药物的联合药敏情况,分析它们之间的联合药敏情况,试图开辟治疗Pae感染新的途径,在用药选择、降低用药量和毒副作用方面起到一定作用。 2、多药耐药铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶和16SrRNA甲基化酶基因分析针对临床分离的Pae菌株,采用聚合酶链反应分析氨基糖苷类修饰酶、16SrRNA甲基化酶基因型及其它基因型,运用SPSS统计分析软件对菌株样本亲缘性做聚类分析。 3、整合子的鉴定与分析利用PCR方法,通过扩增整合子恒定区的方法,筛选携带整合子的菌株,并利用限制性片段多态性性(RFLP)酶切分析的方法对这些整合子进行分类;对整合子恒定区扩增阳性的菌株进行测序和序列分析。探讨整合子携带的耐药基因盒是否介导铜绿假单胞菌的多重耐药。研究结果 1、铜绿假单胞菌对三类六种抗生素耐药率普遍较高,分别为奈替米星68.3%、妥布霉素65.0%、庆大霉素60.0%、环丙沙星46.7%、亚氨培南40.0%、阿米卡星13.3%,而多黏菌素B的耐药率为0;这些菌株中多重耐药和泛耐药菌的检出率分别为55.0%(33/60)和31.7%(19/60)。多黏菌素B与环丙沙星、亚氨培南有明显联合抗菌效应,多黏菌素B与奈替米星联合,能明显降低彼此的MICG。各种抗生素对住院病例分离菌株和门诊病例分离菌株,在MICG和差异显著性方面表现各不相同。 2、21株氨基糖苷类耐药菌株中(其中20株为多药耐药菌株),氨基糖苷类耐药基因型aac(6,)-Ⅰ阳性13株(61.9%)、aac(6,)-Ⅱ阳性13株(61.9%)、ant(2,,)-Ⅰ阳性10株(47.6%)、ant(3,,)-Ⅰ阳性9株(42.9%)、aac(3)-Ⅱ阳性的有1株(4.8%),另有1株菌oprD2基因缺失,未检出基因型aac(6,)-Ⅰae、aph(3,)-Ⅲ、aac(6,)-aph(2,,)和ant(4,)-Ⅰ;16SrRNA甲基化酶基因rmtA基因型阳性19株(90.4%)、armA基

关键词：铜绿假单胞菌琼脂稀释法氨基糖苷类修饰酶基因 16SrRNA甲基化酶基因聚类分析整合子多重耐药 PCR RFLP 耐药基因盒