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球拟假丝酵母生物合成槐糖脂及其衍生物研究进展

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中国生物工程杂志 2017年第9期37卷 134-140页

作者：张亚光张传波卢文玉天津大学化工学院生物工程系系统生物工程教育部重点实验室天津化学化工协同创新中心合成生物学平台天津300072

槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂,因其低毒性、生物可降解性、生物相容性及良好的生物活性而备受关注,利用球拟假丝酵母生产生物表面活性剂槐糖脂极大地加速了其产业化进程。对槐糖脂在球拟假丝酵母中的生物合成途径、关键酶的特点和... 详细信息

槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂,因其低毒性、生物可降解性、生物相容性及良好的生物活性而备受关注,利用球拟假丝酵母生产生物表面活性剂槐糖脂极大地加速了其产业化进程。对槐糖脂在球拟假丝酵母中的生物合成途径、关键酶的特点和基因工程改造假丝酵母合成新型生物表面活性剂的最新进展进行了综述。为扩展球拟假丝酵母作为糖脂化合物合成底盘细胞提供建议和前景分析。

关键词：槐糖脂球拟假丝酵母生物合成

球拟假丝酵母产槐糖脂的发酵条件优化及工程菌株的构建

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球拟假丝酵母产槐糖脂的发酵条件优化及工程菌株的构建

作者：高娜山东大学

学位级别：硕士

表面活性剂可以作为提高乳化性、溶解性以及分散性的物质,其应用可以覆盖我们的工业生产如化工产业和我们的日常生活如食品、药物等各个方面。特别地,近年来由微生物产生的生物表面活性剂,由于其优异的表面活性、良好的环境友好性和可... 详细信息

表面活性剂可以作为提高乳化性、溶解性以及分散性的物质,其应用可以覆盖我们的工业生产如化工产业和我们的日常生活如食品、药物等各个方面。特别地,近年来由微生物产生的生物表面活性剂,由于其优异的表面活性、良好的环境友好性和可降解性而受到持续关注。槐糖脂作为其中一种重要的糖脂类生物表面活性剂而被广泛用于食品行业、日化行业、医药行业以及环境保护等诸多领域。目前,较高的生产成本及较低的产量成为制约槐糖脂生产应用的两个主要因素。因此,降低其生产成本并提高其产量,研究者们开展了大量研究工作。本论文在降低槐糖脂的生产成本方面主要从对其发酵培养基进行优化和对其生产菌株进行遗传改造两方面进行了研究。本论文的主要研究内容及结果如下:1.球拟假丝酵母产槐糖脂的发酵培养基优化微生物的生长和繁殖需要从基质中连续吸收营养物质以获取能量并合成代谢物。为了研究微生物的生长繁殖以及代谢物的合成,首先要了解微生物的营养需求和培养条件,以便有效控制微生物的生长繁殖和产物代谢,达到工业化生产的目的。因此,研究微生物的营养特性和培养条件,进行发酵培养基的有效优化是实现微生物发酵产业化的一个关键因素。发酵培养基的优化路线一般分为两步,首先优先确定主要影响因素,然后通过多因子实验进一步优化培养基各成分的最适浓度。在本论文采用Plackett-Burman设计和中心组合设计对球拟假丝酵母产槐糖脂的发酵培养基进行了有效优化,优化后的槐糖脂产量由53.2 g/L增加到72.2 g/L,产量提高了约38%。2.透明颤菌血红蛋白基因在球拟假丝酵母中的功能研究好氧微生物在发酵的过程中,必须持续不断通入无菌空气,氧气先由气相溶解到液相,再为细胞所吸收,用于菌体生长以及代谢产物的合成。因此,发酵液中的溶解氧水平对细胞的生长和代谢物的合成具有重要的生理作用。目前发酵过程常用的氧控制方法有:(1)提高设备供氧能力,如提高搅拌转速等;(2)增加空气总压,或者是进行富氧通气,从而提高氧分压;(3)控制菌体对氧的消耗速率。这些方法往往对设备要求高,用于槐糖脂的工业化生产中导致成本较高。值得注意的是,目前几乎没有任何关于以基因工程技术对产槐糖脂菌株的摄氧能力进行菌种改良的报道。本论文通过遗传操作将透明颤菌血红蛋白基因vgb整合到球拟假丝酵母基因组中,构建了一株对氧气利用能力大幅提高的重组菌株。在摇瓶发酵实验中,不同的转速条件下(110 rpm,150 rpm,200 rpm),槐糖脂的产量分别提高了 18.4%。,65%,18.2%。在1L发酵罐的发酵实验中,不同转速条件下(400 rpm,600 rpm),槐糖脂的产量分别提高了24%,33%。重组菌株在400 rpm条件下的槐糖脂产量接近于野生型菌株在600 rpm条件下的产量,显示出极好的工业应用前景。3.利用木质纤维素原料产槐糖脂系列工程菌株的构建目前,未能实现槐糖脂大规模工业化的主要原因之一是生产成本较高。发酵过程中需要包括亲水性碳源(葡萄糖)和疏水性碳源(脂肪酸)在内的两种碳源,其中亲水性碳源葡萄糖的用量达到80 g/L。木质纤维素是由约14,000个左右的葡萄糖单元组成的长链β-D-葡萄糖,是自然界中含量最为丰富的一种可再生资源。以纤维素资源取代糖类是目前发酵工业上降低原料成本的一种重要的方式,然而产槐糖脂的球拟假丝菌株不能直接利用纤维素原料,如何使槐糖脂产生酵母能够利用生产质资源直接产生槐糖脂就成一个挑战。在本文中,通过基因工程技术构建了表达草酸青霉的主要纤维素酶基因eg1,eg2,bg1,cbh 的系列球拟假丝酵母重组菌株EG1,EG2,BGL1以及CBH2。为了使各基因协同发挥作用,我们采用了菌株共培养的策略,以1%的磷酸膨胀纤维素为底物进行了发酵实验。结果表明,通过共培养重组菌株降解磷酸膨胀纤维素所产生的槐糖脂总量是野生型菌株的2.6倍,表明该系列重组菌株水解木质纤维生产槐糖脂的优势,初步实现了利用木质纤维素原料生产槐糖脂的设想。

关键词：球拟假丝酵母槐糖脂发酵优化 vgb基因纤维素酶基因异源表达

槐糖脂的生物合成及其高产菌株遗传育种研究进展

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吉林农业大学学报 2024年第4期46卷 531-537页

作者：于潇潇孙严刘力莹边思佳陈光吉林农业大学生命科学学院长春130118

槐糖脂是糖脂类生物表面活性剂,因其具有良好的表面活性和稳定性,且某些结构槐糖脂具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等生物活性,且具有低毒、生物相容性好、可生物降解等优良特性,使其在很多领域具有重要的研究价值和应用潜力。探讨槐糖脂的生产... 详细信息

槐糖脂是糖脂类生物表面活性剂,因其具有良好的表面活性和稳定性,且某些结构槐糖脂具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等生物活性,且具有低毒、生物相容性好、可生物降解等优良特性,使其在很多领域具有重要的研究价值和应用潜力。探讨槐糖脂的生产菌株及其产物特点,并对槐糖脂高产菌株Starmerella bombicola在提高其基质转化得率和改善其产物多样性遗传改造方面的研究进展进行综述,包括传统育种和代谢育种的研究进展。在此基础上,对Starmerella bombicola进一步改造的思路和想法进行展望。

关键词：槐糖脂球拟假丝酵母传统选育代谢育种

Starmerella bombicola的基因组简化与槐糖脂合成关键酶及相关转录因子的功能研究

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Starmerella bombicola的基因组简化与槐糖脂合成关键酶及相关转...

作者：李越山东大学

学位级别：硕士

表面活性剂具有润湿、乳化、发泡、增溶、分散、洗涤等一系列物理化学作用在日常生活和诸多工业领域应用广泛。市场上的表面活性剂一般是用石油化工产品化学合成的,其生产消耗大量的石油资源,而且使用完毕后进入土壤和水体中的表面活性... 详细信息

表面活性剂具有润湿、乳化、发泡、增溶、分散、洗涤等一系列物理化学作用在日常生活和诸多工业领域应用广泛。市场上的表面活性剂一般是用石油化工产品化学合成的,其生产消耗大量的石油资源,而且使用完毕后进入土壤和水体中的表面活性剂很难被清除,有些表面活性剂降解之后的产物具有比其本身更大的毒性,对环境造成严重的污染。生物表面活性剂与化学合成表面活性剂性能相似,但相较于化学表面活性剂,生物表面活性剂具有很多优点,如无毒或低毒,生物可降解,良好的生物相容性,可再生,环境友好,在极端条件下具有更好的选择性和专一性等。槐糖脂是目前已知的生物表面活性剂中最具潜力的表面活性剂之一,有希望成为化学表面活性剂的替代品。作为生物表面活性剂,槐糖脂除了表现出可溶解性、乳化、湿润、发泡等化学表面活性剂的一般特性,还具有化学表面活性剂不具有的毒性低、容易降解、不污染环境的特点。此外,槐糖脂还具有抗肿瘤、抗菌、抗炎等其他有益的生物活性,在作为抗菌和抗癌剂方面很有开发潜力。然而,与石油基的化学表面活性剂相比,槐糖脂较高的生产成本是其大规模应用的阻碍,因此诸多研究致力于通过各种方法提高槐糖脂的产量。在本论文中,主要从Starmerella bombicola的基因组精简和槐糖脂合成潜在相关转录因子的筛选及关键酶基因的异源表达进行研究,研究内容和结果如下:1.球拟假丝酵母基因组的精简及槐糖脂合成关键酶基因的异源表达槐糖脂是由非致病性酵母合成的次级代谢物,酵母中其他代谢途径必然会影响其合成过程中底物和能量的利用效率和转化率。适度减少基因组中的非必需基因可以优化细胞的代谢途径,提高细胞的可控性和可预测性,有可能提高目标产物槐糖脂的产量。在本论文中,通过生物信息学手段分析预测出***中可能存在的基因组岛区域。使用以反向筛选标记upp构建的无痕编辑质粒（PICZαHU）,在不引入其余外源基因的基础上在构建的出发菌株Δupp::six中成功敲除预测的一个基因片段,并且通过摇瓶发酵实验证明该片段的删除不影响***生产槐糖脂的性能。实验证明了构建的无痕基因编辑质粒的可操作性,也增加了在***中进行基因操作的方法选择。在本论文中,还尝试对槐糖脂合成的关键酶基因在毕赤酵母中进行异源表达。槐糖脂合成的关键酶UDP-葡糖基转移酶UGTA1的编码基因gme374,UDP-葡糖基转移酶UGTB1的编码基因gem377在毕赤酵母GS115中得到初步诱导表达。2.槐糖脂合成相关潜在转录因子的初步研究槐糖脂的产量受到培养基中底物的组成比例与成分、培养的温度、pH、转速、溶氧等条件的影响。除此之外,***中与槐糖脂合成相关的转录调控因子或槐糖脂合成关键酶的表达水平,也会影响到槐糖脂的产量。通过对***的全基因组数据和已知的真菌转录因子数据库的对比分析,找到158个转录因子的编码基因,通过分别构建部分转录因子的敲除株对影响槐糖脂生产的潜在转录因子进行筛选,最终筛选到对槐糖脂的合成有重要影响的转录因子gme2655,敲除菌株Δ2655不再产生槐糖脂,而在过表达菌株oe2655中,槐糖脂的生产正常并相较于野生型菌株提高了 25.6%。通过Δ2655和oe2655菌株的荧光定量和转录组学分析,发现敲除菌株中用于槐糖脂转运出细胞的基因被显著下调和富集,而过表达菌株中相关运输蛋白在差异基因分析中未被富集,与野生株的表达水平相当。表明该基因在***槐糖脂合成中是必需基因,可以将此基因作为构建槐糖脂高产菌株的靶标基因。

关键词：球拟假丝酵母槐糖脂基因组精简基因组岛异源表达转录因子

基因工程菌株的槐糖脂的发酵条件优化及其应用

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基因工程菌株的槐糖脂的发酵条件优化及其应用

作者：赵国芹山东大学

学位级别：硕士

近几十年来,经济和可持续生物工艺的发展已逐步取代了以石油化学为基础的现有产品合成方法。槐糖脂作为一种由一些属种的非致病性酵母菌利用可再生的天然原料发酵产生的生物表面活性剂,除具有良好的发泡、润湿、乳化等一般特性外,还具... 详细信息

近几十年来,经济和可持续生物工艺的发展已逐步取代了以石油化学为基础的现有产品合成方法。槐糖脂作为一种由一些属种的非致病性酵母菌利用可再生的天然原料发酵产生的生物表面活性剂,除具有良好的发泡、润湿、乳化等一般特性外,还具有低毒、生物相容性好、可生物降解等优良特性。由于其上述的优良特性,在石油、食品、日化、医药和环境保护等方面具有广泛的应用。然而与石油基来源的化学表面活性剂相对低廉的生产成本相比,槐糖脂大规模生产的高成本仍然是其经济竞争力的障碍,而且槐糖脂的实际应用并没有被真正的突破。在本论文中,主要从槐糖脂发酵条件优化及其应用两方面进行了研究,主要研究内容及结果如下:1.基因工程菌株的构建及其发酵条件的优化槐糖脂作为一种微生物表面活性剂,根据结构,主要分为酸型槐糖脂和内酯型槐糖脂。鉴于酸型和内酯型槐糖脂具有不同的生物学特性,获得能够分别产生酸型或内酯型的基因工程菌株,提高酸型、内酯型槐糖脂的产量,进而达到既降低下游工艺的分离成本,又实现槐糖脂广泛应用的目的。在本论文中,以球拟假丝酵母为出发菌株,通过遗传改造,成功构建了酸型槐糖脂高产菌株Δsble,并在摇瓶和发酵罐水平,对Δsble和本实验室构建的Δrlp△leu3菌株生产槐糖脂的pH、温度和溶氧进行了优化,得到了最适的发酵参数。根据优化结果,Δsble菌株在最优发酵条件下几乎不产内酯型槐糖脂,酸型槐糖脂产量为103.3 g/L,容积生产率为10.3 g/L/d,YSLs/Glu为1.29 g/g。ΔrlpΔleu3菌株在最优发酵条件下产生的内酯型槐糖脂产量为79.1 g/L,占总槐糖脂产量的75.9%,此时,容积生产率为7.91 g/L/d,YSLs/Glu为1.0 g/g。此外,还探究了在7.5 L发酵罐中分批补加葡萄糖和菜籽油对Δsble菌株发酵产酸型槐糖脂的影响,从结果得知,Δsble菌株补料发酵产生的酸型槐糖脂产量达到189.9 g/L,容积生产率为18.99 g/L/d,相比于分批发酵,分别提高了 83.8%、84.4%。2.内酯型槐糖脂抑菌活性的研究寻常痤疮是一种复杂的皮肤疾病,目前已有70～97%的青少年受到不同程度的寻常痤疮困扰。与酸型槐糖脂不同,内酯型槐糖脂具有更好的抗菌、抗病毒和抗生物膜等生物学活性。在本论文中,通过抑菌圈法和营养肉汤稀释法探究了内酯型槐糖脂对痤疮丙酸杆菌和几种常见微生物金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌及白假丝酵母的抑制作用。结果表明,6mg/mL的内酯型槐糖脂能完全抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的生长,而对病原性真菌白假丝酵母的抑制率为68%。本论文首次报道了内酯型槐糖脂对引起痤疮的痤疮丙酸杆菌具有明显的抑制作用,当内酯型槐糖脂浓度达到0.12 mg/mL时就能完全抑制其生长。此外,还考察了马齿苋和黄芩植物提取液对这几种病原性微生物的抑制作用。结果表明1 mg/mL的马齿苋提取液和0.45 mg/mL的黄芩提取液能分别完全抑制这几种常见微生物的生长,这为将内酯型槐糖脂和植物提取液作为抑菌成分加入到软膏制备工艺中来制备新型抗痤疮软膏提供了可能,从而减轻青少年受寻常痤疮的困扰。

关键词：球拟假丝酵母槐糖脂发酵优化分批补料抑菌作用

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槐糖脂的分离制备及抗生物膜活性研究

槐糖脂的分离制备及抗生物膜活性研究

作者：张馨予山东大学

学位级别：硕士

表面活性剂在食品工业,化妆品,石油工业和污水处理等各领域的应用令其成为工业生产中使用最多和推崇的化学品之一。然而,大多数化学合成的表面活性剂衍生自石油产品,大量的石油消耗已经导致资源枯竭和环境污染。因此,必须解决对生态友好... 详细信息

表面活性剂在食品工业,化妆品,石油工业和污水处理等各领域的应用令其成为工业生产中使用最多和推崇的化学品之一。然而,大多数化学合成的表面活性剂衍生自石油产品,大量的石油消耗已经导致资源枯竭和环境污染。因此,必须解决对生态友好,可生物降解和可再生的表面活性剂替代品开发的相关问题。近年来,生物表面活性剂因其良好的生物降解性和生物相容性,较低的毒性,热稳定性和在极端条件下的耐受性越来越受到人们的关注。槐糖脂是具有代表性的糖脂生物表面活性剂之一,凭借其独特性能,在环境保护,食品,医药,医疗保健等不同工业领域的应用得到重视。尤其是医药领域,槐糖脂对细菌,真菌和病毒均具有出色的抗微生物活性。生物膜是微生物以群体方式存在的一种形式,是导致微生物产生抗药性及感染型疾病难以治疗的重要原因之一。已有报道表明槐糖脂具有破坏微生物生物膜的潜力。槐糖脂除了具有其他天然抗菌剂安全性高、广谱性好、长效的优点,同时又具有良好的耐稳定性,完全可以开发作为新型的天然抗菌产品应用在医药行业中抑制生物膜的形成。槐糖脂对于微生物的生物膜的抑制作用的强弱及如何影响生物膜的生理状态,以及根据槐糖脂对生物膜的作用特点,如何将槐糖脂开发为抗生物膜的药物,都需要进一步深入的研究。因此,利用槐糖脂对细菌形成的主要几类生物膜的抑制活性进行系统的研究,研发出有效的控制生物膜形成的材料和方法,具有极大的科学意义和临床现实意义。本论文的主要研究内容和结果如下:1.单一碳源产内酯型槐糖脂的发酵策略及C18:1 DLSL的纯化制备由于天然合成的槐糖脂由20多种不同结构的槐糖脂分子组成,而不同结构槐糖脂的纯度和所占比例都会影响其生物活性,不同的应用和功能需要特定的槐糖脂组分。因此,本工作拟对产槐糖脂菌株球拟假丝酵母（Starmerella bombicola）探究其最佳培养条件并利用基因工程方法生产高生物活性的单一槐糖脂分子双乙酰化十八碳内酯型槐糖脂分子（C18:1 DLSL）。以葡萄糖为单一碳源发酵生产槐糖脂,得到了内酯型槐糖脂比例较高的混合物,并利用制备型HPLC制备得到纯度为95%以上的单一组分槐糖脂分子C18:1 DLSL。在以葡萄糖为单一碳源的情况下通过补料发酵的方法,在300 mL摇瓶发酵过程中补加葡萄糖。在发酵第三天开始每天补料1%葡萄糖的情况下,内酯型槐糖脂产量比非补料发酵条件下提高近一倍。通过构建内酯化酶sble过表达菌株将内酯型槐糖脂产量由野生型菌株的1.79 g/L提高到4.16 g/L,提高了 1.3倍。内酯型产量的提高能够降低分离纯化C18:1 DLSL的成本,为研究C18:1 DLSL的应用潜力提供了条件。2.槐糖脂抗菌和抗生物膜活性的探究目前,关于单一槐糖脂分子纯品的抗微生物活性研究较少,鉴于C18:1 DLSL优异的生物活性,以两种常见致病菌金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌为研究对象,探究高纯度C18:1 DLSL和粗品内酯型槐糖脂的抗菌和抗生物膜活性。纯品C18:1 DLSL和内酯型槐糖脂完全抑制浮游状态的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的浓度分别为15 mg/L和1500 mg/L。而对于浮游状态的革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌,不论是C18:1 DLSL还是粗品内酯型槐糖脂均没有产生有效的抑制作用。另外,首次报道了纯品C18:1 DLSL对于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用和对其成熟生物膜的驱散作用,并且发现C18:1 DLSL对铜绿假单胞菌生物膜状态下的最小抑菌浓度低于浮游微状态下。当C18:1 DLSL浓度为20 mg/L时,对于金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜的抑制率分别是89%和70%。而内酯型槐糖脂的抗菌和抗生物膜活性与C18:1 DLSL相比均较弱。通过扫描电镜观察,经过C18:1 DLSL和内酯型槐糖脂处理后,金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的菌体数量明显减少且细胞变小,细菌形态发生明显改变,细胞破碎,不定型基质物的附着减少。3.槐糖脂与锌离子的组合物在开发抗医疗导管中生物膜活性的初步研究目前,利用微生物产生的槐糖脂生物表面活性剂与锌离子组合后用于开发抗医疗导管中生物膜活性的研究还未见报道。本工作旨在通过探究C18:1 DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子组合后的协同抗菌和抗生物膜活性,研究和开发医疗导管中槐糖脂与锌离子组合材料的抗生物膜涂层。研究结果表明,当C18:1 DLSL在极低的浓度（12 mg/L）的情况下同时添加锌离子（40 mg/L）时就能够抑制80%以上的金黄色葡萄球菌生物膜,较C18:1 DLSL和锌离子在相同浓度下单独作用时的20%和30%左右,作用明显增强。内酯型槐糖脂与锌离子组合作用下对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显同样大于相同浓度下的单独作用。表明C18:1 DLSL/内酯型槐糖脂与锌离子的组合物对于浮游状态和生物膜状态的金黄色

关键词：球拟假丝酵母槐糖脂生物膜锌离子