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中国农业科学 2014年第18期47卷 3577-3587页

作者：徐妙邬洋杨燕夏立秋湖南师范大学生命科学学院/微生物分子生物学国家重点实验室培育基地

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷... 详细信息

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白(cyclic AMP receptor protein,Crp)基因在刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因(crp),通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-PermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子PermE的控制下;PCR扩增PermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-PermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-PermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-PermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-PermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株***-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株***-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株***-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株***-1相比,液体培养基中工程菌株***-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于***-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高,分支较少,有利于提高工程菌株***-Crp发酵过程中的溶氧水平。摇瓶发酵结果表明,工程菌株中的多杀菌素产量与对照菌株相比提高了128%。【结论】crp的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响,并有效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成,为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。

关键词：刺糖多孢菌环腺苷酸受体蛋白过量表达多杀菌素 Red/ET重组

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阴道加德纳菌环腺苷酸受体蛋白的结构与功能研究

阴道加德纳菌环腺苷酸受体蛋白的结构与功能研究

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作者：王帅山东大学

学位级别：硕士

细菌性阴道病（Bacterial vaginosis,BV）是最为普遍的阴道疾病,主要因阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis,GV）过度生长导致,会造成患者瘙痒,灼热,疼痛,分泌物异味等症状,也会增加性传播疾病感染以及盆腔炎,不育与早产风险。BV在全... 详细信息

细菌性阴道病（Bacterial vaginosis,BV）是最为普遍的阴道疾病,主要因阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis,GV）过度生长导致,会造成患者瘙痒,灼热,疼痛,分泌物异味等症状,也会增加性传播疾病感染以及盆腔炎,不育与早产风险。BV在全球的普遍流行率高达29%,目前主要治疗方法为抗生素,每年用于BV的治疗费用高达96亿美元。阴道加德纳菌的致病性主要体现在其形成生物被膜（提高耐药性）以及释放毒力因子（使宿主细胞死亡）。这两者的形成会直接或者间接受到环腺苷酸受体蛋白（cAMP receptor protein,CRP）的调控,CRP在结合配体后构象改变,影响对下游启动子DNA的亲和力。针对致病菌CRP结构所设计的药物可用于疾病治疗,所以探索阴道加德纳菌CRP（CRPGv）的结构与变构机制,对寻找潜在药物靶点有重要意义。本文的主要研究成果如下:1.解析得到分辨率2.22 （?）的CRPGv蛋白结构通过对CRPGv蛋白进行表达纯化,得到纯度超过95%的蛋白溶液。经过晶体普筛与优化,得到质量较好的蛋白晶体。收集衍射数据,经结构解析得到2.22 （?）的蛋白结构。结构显示CRPGv主体结构与其同源蛋白类似,但CRPGv前23位氨基酸插入了cAMP结合结构域空腔之中,这与其它大部分同源蛋白处于不同状态;结合DNA的两段α螺旋处于暴露状态,两者距离小于同源蛋白,为35.1 （?）,可能处于有DNA结合活力的状态;结构中不含小分子配体。***不结合已知配体生物信息学分析结果显示,cAMP作为CRPGv配体的可能性最大。但经过ITC,VP-DSC,HPLC,EMSA,CD,胰酶耐受性实验等多种方法鉴定,cAMP不能与CRPGv产生相互作用,并非其配体。后验证cGMP,c-di-GMP,c-di-AMP,OCPA,α-Ketoglutaric acid配体对CRPGv状态无影响,并非其变构配体。这说明CRPGv可能存在新的调控以及变构机制（与未知配体互作进行变构,或者与蛋白互作进行变构调节）。*** 结合 TGTGA-N6-TCACA 的 DNA box使用启动子预测网站对GV的基因组序列进行预测,得到得分最高的98条启动子DNA,使用EMSA实验进行验证,CRPGv结合其中Promoter 29。其序列与CRP经典box序列TGTGA-N6-TCACA仅相差1个核苷酸,与经典box序列进行EMSA分析,显示出更强的结合力,进一步证实CRPGv特异性结合TGTGA-N6-TCACA序列,处于活性构象的CRPGv为筛选药物提供了结构基础。4.关键位点的氨基酸突变对CRPGv无影响通过构建突变体蛋白,探究CRPGv变构机制。参照同源蛋白突变体,在CRPGv对应氨基酸位点进行定点突变,构建了 A162D,A162S,D159L,D159N,K166S,N148L/N149I,N149I,R163H,N148L蛋白突变体,通过多方面实验检测,以及使用AlphaFold 2.0进行结构预测,发现可以引起同源蛋白进行结构以及活性改变的氨基酸突变对CRPG、并不适用,未产生结构与功能的变化。

关键词：阴道加德纳菌环腺苷酸受体蛋白变构机制 CRPGv

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霍乱弧菌中环腺苷酸受体蛋白对高丝氨酸脱氢酶基因的调控作用

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生物技术通讯 2014年第4期25卷 504-507页

作者：蔡红艳陈保立梁未丽王多春李杰段国贤阚飙河北联合大学基础医学院河北唐山063000 山东省疾病预防控制中心山东省传染病预防控制重点实验室山东济南250014 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的:研究霍乱弧菌中环腺苷酸受体蛋白(CRP)对高丝氨酸脱氢酶(HDH)是否具有调控作用。方法:通过搭桥PCR将HDH基因启动子中CRP潜在结合位点替换为CRP保守结合位点,分别将替换前后的启动子序列导入报告质粒,转化霍乱弧菌野生株C7258及CRP... 详细信息

目的:研究霍乱弧菌中环腺苷酸受体蛋白(CRP)对高丝氨酸脱氢酶(HDH)是否具有调控作用。方法:通过搭桥PCR将HDH基因启动子中CRP潜在结合位点替换为CRP保守结合位点,分别将替换前后的启动子序列导入报告质粒,转化霍乱弧菌野生株C7258及CRP缺失株WL7258,比较荧光值的差异。结果:改造前报告质粒在野生株中的荧光值高于CRP缺失株,改造后报告质粒的荧光值在2株菌中均有升高,但在野生株中升高更明显。结论:CRP调控HDH的转录,但不是惟一调控因素。

关键词：环腺苷酸受体蛋白高丝氨酸脱氢酶天冬氨酸霍乱弧菌

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遗传改造刺糖多孢菌构建多杀菌素高产菌株

遗传改造刺糖多孢菌构建多杀菌素高产菌株

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作者：徐妙湖南师范大学

学位级别：硕士

土壤放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）产生的次级代谢产物多杀菌素（Spinosyns）是一种新型大环内酯类天然产物,具有高效生物杀虫活性,是理想的绿色生物杀虫剂。但是野生刺糖多孢菌合成多杀菌素的能力较弱、产量极低,因此... 详细信息

土壤放线菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）产生的次级代谢产物多杀菌素（Spinosyns）是一种新型大环内酯类天然产物,具有高效生物杀虫活性,是理想的绿色生物杀虫剂。但是野生刺糖多孢菌合成多杀菌素的能力较弱、产量极低,因此,利用基因工程技术定向改造刺糖多孢菌,有望成为提高多杀菌素产量的有效方法。本研究利用PCR扩增了环腺苷酸受体蛋白基因crp和细胞分裂激活因子基因ssgA,利用酶切、连接的方法将crp与ssgA分别置于红霉素增强型启动子PermE的控制之下。随后利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp基因片段和PermE-ssgA基因片段分别亚克隆到本室构建的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建获得重组载体pUC-spn-PermE-crp和pUC-spn-PermE-ssgA。通过接合转移方法将重组载体分别导入刺糖多孢菌中,利用单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,获得了遗传性能稳定的重组工程菌株***-Crp和***-SsgA。借用扫描电子显微镜观察工程菌株菌丝体形态变化,结果显示,工程菌株***-SsgA菌丝片段化程度较对照菌株高,并形成了一定数量的孢子隔膜;采用高效液相色谱检测多杀菌素生物合成情况,摇瓶发酵结果表明,与对照菌株相比,工程菌株***-Crp中的多杀菌素产量提高1.28倍,工程菌株***-SsgA中多杀菌素产量与对照菌株相比提高了 1.55倍;RT-qPCR结果显示工程菌中相应基因的转录水平上调。这些结果表明crp与ssgA的过表达对刺糖多孢菌的形态及生长产生了一定的影响,并有效地促进了刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成。丁烯基多杀菌素（butenyl-spinosyns）由须糖多孢菌（Saccharopolyspora pogona）产生,分子结构与多杀菌素高度类似,其杀虫活性与多杀菌素相比更高,但野生型须糖多孢菌菌株中丁烯基多杀菌素的产量极低。3’-O-甲基鼠李糖是丁烯基多杀菌素发挥活性的重要组成成分,同时也是该菌株细胞壁的组成成分。为了提高丁烯基多杀菌素合成关键底物3’-O-甲基鼠李糖的合成,本研究扩增了三段分散排列在刺糖多孢菌基因组上的鼠李糖生物合成基因gtt、epi和gdh+kre,并将其克隆至大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pJN100上,构建成鼠李糖表达载体pJNRM;通过接合转移方式将其导入须糖多孢菌菌株中,获得了鼠李糖生物合成基因加倍的工程菌株SPOG-RM。PCR鉴定结果表明,该质粒已成功地整合至须糖多孢菌基因组上;实时荧光定量PCR结果显示,工程菌中gtt、epi、kre和gdh基因的转录水平分别比原始菌株提高了54.1倍、26.8倍、14.0倍和11.9倍;HPLC检测结果表明,重组工程菌SPOG-RM中丁烯基多杀菌素产量比原始菌株提高了214%。总之,本研究通过定向遗传改造的方法,首次实现了正调控基因crp和ssgA的在刺糖多孢菌中的过表达,以及鼠李糖生物合成基因在须糖多孢菌菌株中的过表达,有效地促进了多杀菌素及丁烯基多杀菌素的生物合成,证明了此方法的高效可行性,为通过其它正调控基因或限速酶基因的超量表达提高多杀菌素及其类似物的生物合成奠定了重要基础。

关键词：刺糖多孢菌多杀菌素 Red/ET同源重组环腺苷酸受体蛋白细胞分裂激活因子鼠李糖生物合成基因

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