检索结果-南通市图书馆

环糊精葡萄糖基转移酶my20结构域删除突变体的表达和酶学性能

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

食品科学 2024年

作者：孙腾腾王伟孙晶晶江承程郝建华江苏省海洋生物资源与环境重点实验室江苏海洋大学农业农村部极地渔业可持续利用重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase，简称CGTase)属于糖苷水解酶α-淀粉酶家族(家族13)，能够催化环化反应产环糊精（Cyclodextrin，简称CD），包含A、B、C、D、E5个结构域，其中D、E结构域是其所特有的结构域，在... 详细信息

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextringlycosyltransferase，简称CGTase)属于糖苷水解酶α-淀粉酶家族(家族13)，能够催化环化反应产环糊精（Cyclodextrin，简称CD），包含A、B、C、D、E5个结构域，其中D、E结构域是其所特有的结构域，在其他α-淀粉酶中并没有相应的结构域。酶的三级结构与其催化机理密切相关，本文以一种海洋来源环糊精葡萄糖基转移酶my20为研究对象，构建了D、E以及DE结构域截短突变体，通过pET-24a载体和宿主菌E. coli BL21(DE3)进行表达，并利用镍亲和层析柱纯化得到纯酶。my20环化比活力按100%计算，my20△D、my20△E、my20△DE相对环化活力分别约为197%、22%、17%，表明E结构域是CGTase催化环化反应的重要结构域，D结构域的存在可能降低了底物分子进入催化结构域的能力。my20为耐热酶，三种截短突变酶相较之下耐热性均有不同程度的降低，说明D、E结构域在CGTase耐热性方面具有重要的作用。my20在缺失了DE结构域后，催化产物中α-CD占比相较其它截短酶提升约8%，表明缺失了DE结构域影响其产物特异性。本实验为CGTase将来能通过结构域改造，在工业生产方面发挥作用提供了一定理论基础。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶结构域环化活力酶学性质

产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株选育及酶分子改造研究进展

在线全文

同方期刊数据库

学校读者我要写书评

暂无评论

食品与发酵工业 2024年第15期50卷 359-371页

作者：陶大炜张颖琦赵赛赛上海市虹口区疾病预防控制中心上海200082 上海海洋大学食品学院上海201306

环糊精(cyclodextrin,CD)因其内疏水外亲水的特殊结构被广泛运用,而酶法制备CD是常用方法,主要应用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)。该文对产CGT酶的菌株选育和酶分子改造这两方面进行综述,重点讨论提... 详细信息

环糊精(cyclodextrin,CD)因其内疏水外亲水的特殊结构被广泛运用,而酶法制备CD是常用方法,主要应用环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)。该文对产CGT酶的菌株选育和酶分子改造这两方面进行综述,重点讨论提升酶表达量的4种异源表达常用优化策略:产酶条件优化、信号肽选择、启动子优化、密码子优化,以及定点突变、定点饱和突变、易错PCR这3种常用的酶分子改造方法对酶相关特性的影响。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶诱变育种异源表达分子改造

环糊精葡萄糖基转移酶182位点定点改造催化合成糖基化染料木素

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

生物工程学报 2022年第2期38卷 749-759页

作者：柴宝成姜钰琳倪晔韩瑞枝江南大学生物工程学院江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

染料木素及其单糖苷衍物在食品和医药领域具有重要作用,但难溶于水的特性极大地限制了其应用范围,研究表明糖基化反应可有效提高其水溶性。文中针对来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶,研究其对染料木素单糖苷衍生物槐角苷的糖... 详细信息

染料木素及其单糖苷衍物在食品和医药领域具有重要作用,但难溶于水的特性极大地限制了其应用范围,研究表明糖基化反应可有效提高其水溶性。文中针对来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶,研究其对染料木素单糖苷衍生物槐角苷的糖基化反应。通过对D182位点的定点饱和突变,突变酶D182C较WT转化率提高了13.42%,主要糖基化产物(槐角苷单糖苷、二糖苷、三糖苷)分别提高了39.35%、56.05%和64.81%。酶学性质研究发现,D182C较WT的环化、水解、歧化活力均有所提高。且最适pH和温度分别为6和40℃。动力学研究发现,D182C针对底物(糖基供体和受体)的K_(m)值较WT均有所降低,且催化效率k_(cat)/K_(m)则明显提高,说明D182C对底物的亲和力相较于WT有大幅提升。同源建模及分子对接结果表明,突变酶D182C糖基化效率提高的原因可能与底物作用力增加有关。

关键词：染料木素槐角苷环糊精葡萄糖基转移酶水溶性定点饱和突变糖基化反应

环糊精葡萄糖基转移酶在天然产物糖基化修饰中的应用

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

生物技术通报 2022年第3期38卷 246-255页

作者：张国宁冯婧娴杨颖博陈万生肖莹上海中医药大学中药研究所中药资源与生物技术中心上海201203 上海图锋医药科技有限公司上海201203 海军军医大学附属长征医院医疗保障中心上海200003

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)是一种可催化淀粉或多糖中α-1,4键断裂并环化形成环糊精(cyclodextrins,CDs)的α-淀粉酶。CGTase在工业上主要用于制造环糊精,近年来利用其转糖基作用改造天然产物的性... 详细信息

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)是一种可催化淀粉或多糖中α-1,4键断裂并环化形成环糊精(cyclodextrins,CDs)的α-淀粉酶。CGTase在工业上主要用于制造环糊精,近年来利用其转糖基作用改造天然产物的性质取得了令人瞩目的研究进展,正成为CGTase应用颇有前途的发展方向。本文结合CGTase的来源、蛋白结构及催化机制等相关研究,重点介绍近年来CGTase在天然产物糖基化修饰中的应用,为CGTase在该领域的深入研究及应用提供参考。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶蛋白结构天然产物糖基化反应

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

环糊精葡萄糖基转移酶有机溶剂耐受机制研究

环糊精葡萄糖基转移酶有机溶剂耐受机制研究

作者：姜钰琳江南大学

学位级别：硕士

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltranstransferase,简称CGTase)是一种多功能酶,工业上常用于环糊精生产以及多种物质的转糖基应用,研究发现有机溶剂在CGTase的应用中对疏水性底物的助溶及产物特异性的改善等方面具有重要作... 详细信息

环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltranstransferase,简称CGTase)是一种多功能酶,工业上常用于环糊精生产以及多种物质的转糖基应用,研究发现有机溶剂在CGTase的应用中对疏水性底物的助溶及产物特异性的改善等方面具有重要作用。然而,野生型CGTase对于有机溶剂的耐受性较差。因此,本研究以Paenibacillus macerans JFB05-01来源的CGTase(PmCGTase)为研究对象,通过分子改造提高其有机溶剂耐受性,并利用分子动力学模拟解析CGTase的有机溶剂耐受机制。主要研究内容和结果如下:(1)构建重组菌*** BL21(DE3)/p ET28a-PmCGTase,经发酵条件优化后提高了目的蛋白可溶性表达水平。摇瓶16°C发酵18 h,可溶性蛋白表达可达8.2 mg·m L。经镍柱纯化,PmCGTase纯度可达90%以上,比活力为22.3 U·mg。(2)构建PmCGTase有机溶剂耐受性筛选的的高通量方法:将100μL粗酶液与等体积的PBS溶液(或30%DMSO溶剂)混匀后置于4°C静置1 h,随后加入50μL的麦芽糊精(40 g·L),在40°C下反应10 min,立即加入250μL HCl(1 M)和150μL甲基橙终止反应,室温下静置20 min后测定OD。该方法经验证,Z因子为0.6,可以用作有机溶剂耐受性筛选的的高通量方法。(3)基于PmCGTase在水相及有机相中的分子动力学(Molecular dynamics,简称MD)模拟结果,对18个热点进行迭代饱和突变。结果表明,突变酶G539I/R146F/D147N在DMSO、甲醇、乙醇以及丙酮的溶剂耐受性均有提升,其中在30%DMSO中耐受性最高提升至野生型(WT)的1.8倍;而G539V对甲醇、乙醇、丙酮的耐受性提升更明显,最高可达WT的1.7、1.5和1.6倍。此外,G539I/R146F/D147N的转糖基活力有明显提升,且其半衰期较WT提高了60%以上。动力学研究表明,G539I/R146F/D147N在水相和有机溶剂中的k/K较WT分别提高了26.1%和42.0%。在槐角苷的糖基化反应中,其转化率增加了12.0%。基于MD模拟结果分析三突变体G539I/R146F/D147N溶剂耐受性提高的机制,结果显示,其原因可能主要源于蛋白结构刚性的增强。(4)对表面loop残基T599-Y601进行电荷修饰,获得的最佳突变体为T599D/N600D/Y601H,其DMSO、甲醇、乙醇以及丙酮溶剂耐受性分别为WT的2.3倍、4.1倍、1.7倍以及3.0倍。该突变体较WT的环化活力和水解活力分别降低了27.8%和15.4%,歧化活力提升了7.9%,此外,其半衰期仅剩WT的2.2%。动力学研究发现,T599D/N600D/Y601H在有机溶剂中的kK较WT提升了14.6%。在槐角苷的转糖基反应中,T599D/N600D/Y601H在4 h的转化率可达41.9%,是WT的近1.5倍。基于MD模拟结果分析,T599D/N600D/Y601H的有机溶剂耐受性提高可能是表面水化层以及局部结构刚性增强的综合结果。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶分子改造有机溶剂耐受性分子动力学模拟转糖基作用

环糊精葡萄糖基转移酶歧化特性及热稳定性改造

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

环糊精葡萄糖基转移酶歧化特性及热稳定性改造

作者：刘学军齐鲁工业大学

学位级别：硕士

环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclomaltodextrin glucanotransferase,CGTase）广泛存在于细菌、真菌、古细菌等各类微生物中,主要生产菌株是各类芽孢杆菌,如环状芽孢杆菌、软化类芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等。CGTase属于α-淀粉... 详细信息

环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclomaltodextrin glucanotransferase,CGTase）广泛存在于细菌、真菌、古细菌等各类微生物中,主要生产菌株是各类芽孢杆菌,如环状芽孢杆菌、软化类芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等。CGTase属于α-淀粉酶家族（糖苷水解酶13＿2,GH13＿2）,是一种胞外酶,同时也是一种多功能酶,能够以淀粉、麦芽糊精等为底物催化转糖苷反应（歧化、环化和耦合反应）和水解反应。其中,歧化反应是两个不同分子间发生的转糖苷反应,即将直链低聚糖被切断的部分转移到另一受体上。CGTase的应用十分广泛,常见的是利用其环化反应把淀粉转化成环糊精。另外,也常利用CGTase歧化反应生成稳定性提高的糖苷化合物,如将小分子的糖转移到蔗糖或果糖上而生产抗龋齿功能偶合糖;对甜菊苷、鼠李糖、芸香苷、L-抗坏血酸等物质进行糖基化修饰,显著改善其性能。本研究通过合成来源于Bacillus sp.G1的环糊精葡萄糖基转移酶的基因（Bs CGT）来进行歧化特性的改造以及热稳定特性的提高研究,通过定向进化获得了对麦芽糖受体亲和性增强的突变体N33K,可以应用于双酶法合成海藻糖的体系,用以提升海藻糖产率。为适应多酶反应体系条件,又通过半理性改造获得热稳定性提高的突变体N33K/S211G,在最适温度55℃的半衰期提高到94 min。同时,将突变体N33K/S211G在枯草芽孢杆菌进行重组表达,并实现突变体的高效制备。主要研究结果如下:（1）合成源自Bacillus sp.G1的CGTase基因并构建p ET28a/cgt载体以大肠杆菌为宿主进行异源分泌表达。通过理性设计,计算可提高麦芽糖特异性结合的氨基酸残基突变,将CGTase进行定点突变改造,构建获得突变体N33K、N33R、Y119R、Y122E、L216Q、H255Y、E258Y、E258Q、P394R、P394Q、E566H,并进行叠加组合突变获得突变体N33K/E258Q、N33K/P394R、E258Q/P394R和N33K/E258Q/P394R,通过酶反应动力学研究发现突变体N33K的k相比野生型提高58.6%,突变体N33K相较野生型歧化酶活性提高2.10倍,最适温度55℃,最适pH6.0。（2）研究发现突变体N33K热稳定性尚不能满足工业要求,通过进行钙离子结合位点附近氨基酸定向突变,获得突变体N33K/H255W、N33K/H255F、N33K/H255Y、N33K/I212R、N33K/S211G、N33K/S211E,实验发现突变体N33K/S211G最适温度提高到60℃,在50℃、55℃、60℃、65℃条件下的半衰期分别为2.4 h、2.0 h、55.4 min、38.4 min,N33K/S211G在60℃时的半衰期为突变体N33K的2.27倍,歧化酶活性相较于突变体N33K并没有明显变化。（3）对突变重组菌*** BL21/p ET28a-CGTase-N33K/S211G进行摇瓶水平的发酵优化,分别在诱导发酵时间、诱导温度、诱导剂添加量等方面进行了优化,得到了最佳培养条件:最佳生长温度为37℃、最佳诱导温度为25℃、诱导剂最佳添加量为终浓度0.2 m M、最佳诱导发酵时间为8 h。在最优条件下进行摇瓶水平发酵,重组菌所产重组酶歧化酶活性提高28%,歧化酶活达到25.33 U/m L。（4）以麦芽糊精为底物多酶体系复配生成海藻糖的研究中,添加CGTase可将海藻糖转化率提高20%以上,并构建突变体N33K/S211G基因的重组菌*** WB800N,以TB培养基发酵,发酵温度为37℃,发酵时间为48h,最高歧化酶活可达到21.0 U/mL。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶歧化反应热稳定性基因改造

环糊精葡萄糖基转移酶钙离子结合位点结构与功能分析

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

生物化学与生物物理进展 2013年第12期40卷 1239-1246页

作者：班宵逢李才明鲍春辉顾正彪李兆丰江南大学食品学院无锡214122 江南大学食品科学与技术国家重点实验室无锡214122

通过多重序列比对和晶体结构分析发现,钙离子结合位点CaⅠ和CaⅡ普遍存在于环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)中,且两个位点处氨基酸残基具有较高的保守性,而钙离子结合位点CaⅢ仅存在于少数CGT酶中.此外,研究发现,钙离子结合位点可能与CGT... 详细信息

通过多重序列比对和晶体结构分析发现,钙离子结合位点CaⅠ和CaⅡ普遍存在于环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)中,且两个位点处氨基酸残基具有较高的保守性,而钙离子结合位点CaⅢ仅存在于少数CGT酶中.此外,研究发现,钙离子结合位点可能与CGT酶的环化活力、热稳定性和产物特异性密切相关.

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶钙离子结合位点结构功能

环糊精葡萄糖基转移酶的生产及其分离纯化研究进展

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

内蒙古民族大学学报（自然科学版） 2023年第3期38卷 231-236页

作者：张艺凡周文喜王华内蒙古民族大学生命科学与食品学院内蒙古通辽028043 通辽市农牧科学研究所内蒙古通辽028015

环糊精因其特殊的性质而备受食品、化妆品和制药等行业的青睐。对环糊精的巨大需求也使其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase,EC2.***.1.19)成为人们关注的热点。目前,对该酶的研究多集中在作用机制、菌株筛选等方面,从发酵生产到... 详细信息

环糊精因其特殊的性质而备受食品、化妆品和制药等行业的青睐。对环糊精的巨大需求也使其生产所必需的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase,EC2.***.1.19)成为人们关注的热点。目前,对该酶的研究多集中在作用机制、菌株筛选等方面,从发酵生产到分离提纯的系统性报道并不多见,因此,结合国内外对CGTase的大量研究工作和中国的资源优势,笔者以CGTase的发酵生产和分离提纯为出发点,以环糊精产业未来的商业需求为基础,对优质CGTase的发酵生产和提纯方法进行了综述,同时对该领域的未来研究进行了展望。

关键词：环糊精环糊精葡萄糖基转移酶发酵生产分离纯化

Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶Leu277突变提高α-环糊精产量

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

食品与发酵工业 2023年第15期49卷 1-7页

作者：孔德民左方圆吴敬王蕾食品科学与技术国家重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122 工业生物技术教育部重点实验室(江南大学) 江苏无锡214122

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)能够以淀粉为底物发生环化反应生成环糊精,包括α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)、β-环糊精及γ-环糊精,其中α-环糊精产量低且易降解。该研究选择Bacillus stearother... 详细信息

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)能够以淀粉为底物发生环化反应生成环糊精,包括α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)、β-环糊精及γ-环糊精,其中α-环糊精产量低且易降解。该研究选择Bacillus stearothermophilus NO2来源的CGTase,考察其突变体E142P、L277M、L277F、E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A以可溶性淀粉为底物生产α-CD的能力。与野生型相比,最优突变体为E142P/L277M,α-环糊精产量提高1.7 g/L,且在产物中占比提高14.3%。分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟结果表明,E142P/L277M突变体中2个突变位点相互影响较小。此外,L277M/N353A催化效果较差,MD结果表明该突变体整体结构变化较大且溶剂可及表面积增大,不利于转糖苷反应的发生。该研究为CGTase的分子改造提高环化反应活性以及CGTase在α-环糊精工业化生产中提升产量提供了新思路。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶可溶性淀粉 α-环糊精定点突变环化反应