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腺苷酸环化酶的挖掘、表达与固定化

腺苷酸环化酶的挖掘、表达与固定化

作者：宋捷华南理工大学

学位级别：硕士

环磷酸腺苷（cAMP）在人体内对免疫与代谢都有积极的调节作用,c AMP药物主要用于治疗心血管疾病,在畜牧业生产中用作类激素以改善肉蛋品质。目前c AMP的临床原料药的生产主要是化学合成法,存在工艺冗长、污染大、产品不纯等问题。而酶... 详细信息

环磷酸腺苷（cAMP）在人体内对免疫与代谢都有积极的调节作用,c AMP药物主要用于治疗心血管疾病,在畜牧业生产中用作类激素以改善肉蛋品质。目前c AMP的临床原料药的生产主要是化学合成法,存在工艺冗长、污染大、产品不纯等问题。而酶法合成具有工艺简单、条件温和、周期短、副产物少等优点,是一种有效的替代方式。缺少酶资源是酶法合成的瓶颈之一,因此迫切需要挖掘具有良好催化性能的腺苷酸环化酶（AC）。本研究旨在通过基于系统发育学的方法,筛选并挖掘了高效合成c AMP的腺苷酸环化酶,为酶法合成c AMP的应用研究提供了研究基础。具体的研究内容及结果如下:通过对AC进行文献调研,从中筛选具有高效催化性能的AC。将其选作“探针”序列,通过对“探针”序列进行多序列比对后,根据一定的规则筛选候选序列。具体方法为通过对候选序列的蛋白结构进行预测,用Discovery Studio的CDOCKER模块将小分子底物ATP与候选序列的三维结构进行半柔性对接以分析候选蛋白与ATP结合的强弱;根据对接评分的分析,选取评分高的AlAC、TeAC、9AXAC序列的基因并合成。将AlAC、TeAC、9AXAC克隆至pET-28a载体中,转化至大肠杆菌Bl21（DE3）中。诱导表达重组大肠杆菌后,用Ni柱亲和层析纯化获得纯蛋白,经SDS-PAGE分析验证目的蛋白的条带大小为45、40、45 k Da。经酶学性质测定和分析,AlAC、TeAC、9AXAC的最适p H为10,最适温度分别为45、50、50℃,比酶活力分别为35.0、69.9、1.2 U/mg;AlAC、TeAC、9AXAC的K分别为63.34、115.10、64.77 mmol/L,V分别为44.05、64.52、17.61μmol/（mg·min）,K分别为13.35、8.13、8.19 s;热稳定性测定的结果表明AlAC在30和35℃下较稳定,TeAC与其差异较大。在c AMP的催化合成应用中,AlAC的最大产量为19.71 g/L,略高于报道的最高产量18.45 g/L,但其生产效率为1.79g/（L·h）不及后者的3.08 g/（L·h）。提示本研究为酶法合成c AMP提供良好的研究基础。本研究制备了SpyCatcher修饰的羧基磁珠,并用修饰的羧基磁珠对AC进行固定化的初步研究。AlAC和TeAC的固定化效率分别为43.8%和98.9%,酶活回收率分别为32.09±0.48%和2.74±0.04%。酶学性质的测定表明固定化AC能提高该酶对碱性条件的耐受,TeAC的热稳定性提高而AlAC的热稳定性降低。固定化的AlAC和TeAC在连续催化6次,相对酶活力保持80%及以上,实现了AC操作稳定性的提升。

关键词：腺苷酸环化酶环单磷酸腺苷酶挖掘分子对接酶固定化

强啡肽和苯环利定在高血压大鼠的环腺苷酸生成系统中的作用

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神经科学 1995年第1期2卷 14-17页

作者：包维丽张玲妹童杰飞孙凤艳张安中上海医科大学医学神经生物学国家重点实验室

采用放射免疫检测方法，观察了强啡肽（Ｄｙｎ）和苯环利定（ＰＣＰ）对高血压大鼠（ＳＨＲ）的环腺苷酸（ｃＡＭＰ）生成系统的影响．结果表明：Ｄｙｎ剂量依赖地降低ＳＨＲ和非高血压大鼠（ＷＫｙ）的外周血管中ｃＡＭＰ的含量，并且... 详细信息

采用放射免疫检测方法，观察了强啡肽（Ｄｙｎ）和苯环利定（ＰＣＰ）对高血压大鼠（ＳＨＲ）的环腺苷酸（ｃＡＭＰ）生成系统的影响．结果表明：Ｄｙｎ剂量依赖地降低ＳＨＲ和非高血压大鼠（ＷＫｙ）的外周血管中ｃＡＭＰ的含量，并且对ＳＨＲ的ｃＡＭＰ生成系统的抑制作用大于ＷＫｙ（Ｐ＜０．０５）；相反地，ＰＣＰ剂量依赖地升高ＳＮＲ和ＷＫｙ的外周血管中的ｃＡＭＰ的含量，对ＳＨＲ的ｃＡＭＰ生成系统的激活作用小于ＷＫｙ（Ｐ＜０．０５）。这些观察表明：１．Ｄｙｎ和ＰＣＰ通过抑制或激活环腺苷酸生成系统对ＳＨＲ产生作用。２．ＳＨＲ和ＷＫｙ的外周动脉对Ｄｙｎ和ＰＣＰ的敏感性不同。Ｐ＜０．０１ｖｓＷＫｙ．ＥｆｆａｔＯｆ￣ｏｎｃＡＭＰｃｏｎａｌｓｏｆ￣ｎｅＰ￣Ｏｆ￣￣ｉｎＳＨＲａｎｄＷＫｙＩｎ￣ｎｇｃｏｎｒｍｈａｔｉｏｎｏｆＰＣＰ（１０－－＇－－１０－－＇ｍｏｌ／Ｌ）ｉｎｄｕｃｅａｄｏＳｅｄｒｐｅｎｄｅｎｔｉｎＣｒｅａｓｅｉｎｃＡＭＰｌｅＶｅｌｓｉｎｍｅｍｂｒａｎｅｐａ￣ｏｆｂｏｔｈＳＨＲａｎｄＷＫｙ．ＴｈｅＥＣ．ｖａｌｕｅＳｗｅｒｅ９．３ｘ１０－－７ｍｏｌ／ＬｆｏｒＷＫｙａｎｄ５．０ｘ１０－－６ｍｏｌ／ＬｆｏｒＳＨＲ．

关键词：环单磷酸腺苷苯环利定强啡肽高血压

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抑制性神经递质-γ-氨基丁酸（GABA）对胆管癌细胞株QBC939增殖、侵袭转移的影响及其相关机制的研究

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抑制性神经递质-γ-氨基丁酸（GABA）对胆管癌细胞株QBC939增殖、...

作者：刘臣海安徽医科大学

学位级别：硕士

随着现代神经生物学的发展及社会-心理-生物医学模式的提出,神经系统对疾病的影响越来越受人们关注,特别是体内重要的神经递质,其功能也日益被延伸,近年来研究发现肿瘤细胞上存在多种神经递质受体,而且不少神经递质具有影响肿瘤细胞生... 详细信息

随着现代神经生物学的发展及社会-心理-生物医学模式的提出,神经系统对疾病的影响越来越受人们关注,特别是体内重要的神经递质,其功能也日益被延伸,近年来研究发现肿瘤细胞上存在多种神经递质受体,而且不少神经递质具有影响肿瘤细胞生长、迁移、侵袭和转移的作用;γ-氨基丁酸(GABA)是体内重要的抑制性神经递质,它不仅扮演着调节中枢神经的功能,而且对恶性肿瘤的发生发展起着作用;同时神经内分泌系统调节着胆管上皮细胞的病理生理,很多激素、神经肽和神经递质能够影响胆管上皮细胞的生物学特性,但GABA对胆管癌的作用未明;本实验通过体外实验初步探讨抑制性神经递质——GABA对胆管癌细胞增殖和侵袭转移的影响,并通过各种经典的分子生物学方法,研究其内在的相关机制,为阐明GABA的药理作用提供事实依据,也为胆管癌的辅助治疗提供新的思路和方案。目的探讨抑制性神经递质——γ-氨基丁酸对胆管癌细胞株QBC939增殖和侵袭转移的影响,并揭示该影响的内在分子机制。方法常规体外培养胆管癌细胞株QBC939,每日倒置显微镜下观察细胞生长情况。应用不同浓度的GABA处理生长对数期细胞,于作用后的不同时间段收集细胞。采用MTT比色法探讨GABA对胆管癌细胞株QBC939增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,PCR-ELISA法观察其对细胞QBC939端粒酶活性的影响,放射免疫分析法检测癌细胞内cAMP含量。Transwell小室分析GABA对胆管癌细胞侵袭能力的影响,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析GABA对胆管癌细胞QBC939表达基质金属蛋白酶2、9 (matrix metalloproteinase, MMP2、9) mRNA的影响,明胶酶谱法分析GABA对癌细胞上清液中MMP2、MMP9活性的影响结果(1)MTT显示GABA在体外明显抑制细胞QBC939的增殖,抑制作用与药物浓度具有明显的依赖性,随着浓度的增加(1-1000μmol/L),胆管癌细胞的增殖抑制率由2.6%增至26.82%(48h,P<0.05),但没有明显的时间依赖性,以作用48h后抑制效果最明显。(2)流式细胞术检测显示GABA促进细胞凋亡(凋亡率由4.8%增至28.03%,P<0.05),并呈剂量依赖性,对细胞周期无明显影响。(3)与对照组相比,从浓度为10μmol/L的GABA开始,胆管癌细胞中的端粒酶活性即受到明显抑制(0.82±0.048 vs 0.69±0.027,P<0.05),该效应也呈剂量依赖性。(4)放射免疫分析法显示GABA促进胆管癌细胞QBC939内cAMP的生成(100μmol/L,0.59±0.049 nmol/L vs 0.71±0.029nmol/L ,P<0.05),呈剂量依赖性。(5)Transwell小室法分析,GABA抑制胆管癌细胞QBC939穿透Matrigel膜的能力(100μmol/L的GABA,穿透细胞数42.67±4.04 vs 60±9.54个, P< 0.05),剂量增加效应越明显,成剂量依赖性。(6)GABA作用胆管癌细胞QBC939后,基质蛋白酶MMP-2和MMP-9 mRNA的表达减少(100μmol/L处, MMP-2 mRNA : 0.632±0.065 vs 1.107±0.271,MMP-9 mRNA :0.605±0.104 vs 0.891±0.167,P<0.05),胞液中MMP-2和MMP-9的活性下降(1000μmol/L处,Vmmp-2: 46.1±0.025 vs 73.2±0.14,Vmmp-9:11.2±0.035 vs 32.6±0.071,P<0.05),这两种作用均呈剂量依赖性。结论(1)不同浓度的GABA在体外可以抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,该效应呈剂量依赖性,可能的信号传到途径是通过受体后的第二信使——cAMP的信息介导途径,诱导胆管癌细胞凋亡,抑制胆管癌细胞端粒酶的活性。(2)抑制性神经递质——GABA在体外能够减弱胆管癌细胞QBC939侵袭转移能力,其机制与其抑制基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和活性有关

关键词：胆管肿瘤 Y-氨基丁酸细胞增殖凋亡端粒酶基质蛋白酶侵袭转移环单磷酸腺苷

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青蒿总香豆素解热作用及其机理初步研究

中国实验方剂学杂志 2008年第12期14卷 49-52页

作者：宫毓静闫寒李爱媛赵一林启云李沧海中国中医科学院医学实验中心北京100700 广西中医学院广西南宁530001

目的:研究青蒿总香豆素解热(降温)作用并探讨其作用机理。方法:从黄花蒿中提取总香豆素,利用内生致热原性家兔发热模型,观察青蒿总香豆素对发热家兔体温的影响并测定脑脊液、血清中前列腺素E2(PGE2)、环单磷酸腺苷(cAMP)水平以及肝脏、... 详细信息

目的:研究青蒿总香豆素解热(降温)作用并探讨其作用机理。方法:从黄花蒿中提取总香豆素,利用内生致热原性家兔发热模型,观察青蒿总香豆素对发热家兔体温的影响并测定脑脊液、血清中前列腺素E2(PGE2)、环单磷酸腺苷(cAMP)水平以及肝脏、腓肠肌钠泵活性。结果:青蒿总香豆素可以显著降低正常及发热家兔体温,抑制肝脏、腓肠肌组织钠泵活性,降低发热家兔血液及脑脊液PGE2水平,对血液及脑脊液cAMP水平变化无明显影响。结论:香豆素成分可能是青蒿解热降温的有效部位,其作用机制与抑制钠泵活性及降低中枢PGE2水平有关。

关键词：黄花蒿香豆素发热前列腺素E2 环单磷酸腺苷钠泵

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cAMP促进成年哺乳动物中枢神经系统再生分子机制的研究进展

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国际神经病学神经外科学杂志 2010年第1期37卷 88-91页

作者：吴园园李涵杨萍第三军医大学学员旅二队重庆市400038 第三军医大学神经生物学教研室重庆市400038

近年来神经科学工作者对cAMP促进成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)神经再生的分子机制进行了大量的研究,结果表明cAMP通过激活其下游分子PKA、Epac、提高IL-6的水平、磷酸化RhoA以及与Ca2+通路相互作用等机制促进CNS再生。本文对cAMP促进... 详细信息

近年来神经科学工作者对cAMP促进成年哺乳动物中枢神经系统(CNS)神经再生的分子机制进行了大量的研究,结果表明cAMP通过激活其下游分子PKA、Epac、提高IL-6的水平、磷酸化RhoA以及与Ca2+通路相互作用等机制促进CNS再生。本文对cAMP促进CNS再生机制的研究进展进行综述,并探究有效提高神经元内cAMP水平的策略。

关键词：环单磷酸腺苷蛋白激酶A Epac 白细胞介素-6 RhoA 钙离子中枢神经系统再生

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