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酶促4+2和2+2环加成反应:区域与立体选择性的理解与应用

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合成生物学 2024年第3期5卷 401-407页

作者：汤志军胡友财刘文中国科学院上海有机化学研究所生命过程小分子调控全国重点实验室上海200032 中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室北京100050

4+2和2+2环加成反应均是构筑环结构的重要有机化学反应,在复杂天然产物、手性药物的化学合成和生物合成方面有广泛的应用。发现、发展包括4+2和2+2在内的酶促环加成反应,是当前化学生物学研究的热点之一。近期,国际、国内研究团队相继... 详细信息

4+2和2+2环加成反应均是构筑环结构的重要有机化学反应,在复杂天然产物、手性药物的化学合成和生物合成方面有广泛的应用。发现、发展包括4+2和2+2在内的酶促环加成反应,是当前化学生物学研究的热点之一。近期,国际、国内研究团队相继报道了多个酶促4+2和2+2环加成反应,解析了环化酶的蛋白结构和催化机制,设计了新的环化酶,或通过定向进化实现了不同类型环加成反应的区域和立体选择性调控。相关研究为采用合成生物学的策略设计和优化新型环加成酶提供了理论基础和成功范例,有利于促进酶促反应在有机合成领域的应用。

关键词： 4+2环加成反应 2+2环加成反应化学合成和生物合成环化酶定向进化

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杨树环化酶基因Potri.006G237100功能分析

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杨树环化酶基因Potri.006G237100功能分析

作者：贾志刚东北林业大学

学位级别：硕士

环化酶是一种催化核苷三磷酸生成环核苷酸的酶,广泛存在于动物、植物、微生物。环化酶编码基因呈现基因家族特征,在植物中存在多种类型,参与植物的多种生物学功能。研究报道,水稻的一类环化酶通过控制活性氧水平参与逆境胁迫。番茄红素... 详细信息

环化酶是一种催化核苷三磷酸生成环核苷酸的酶,广泛存在于动物、植物、微生物。环化酶编码基因呈现基因家族特征,在植物中存在多种类型,参与植物的多种生物学功能。研究报道,水稻的一类环化酶通过控制活性氧水平参与逆境胁迫。番茄红素ε-环化酶基因过量表达与光合作用有关,番茄红素β-环化酶基因参与小麦β-胡萝卜素生物合成。丙二烯环化酶基因参与作物的耐盐性,过量表达该基因增加水稻在高盐度环境下生物量,这种功能在小麦中也有类似报道。然而,环化酶基因在树木中的研究信息或功能,却报道甚少。在前期研究中我们分离一个杨树环化酶基因Potri.006G237100,它可能参与木材形成。为了鉴定该基因的功能,取得的主要研究结果如下：毛果杨环化酶基因Potri.006G237100编码区全长CDS序列含507个核苷酸,编码169个氨基酸。同源性检索显示,拟南芥、大豆及葡萄等不同植物物种均存在其同源基因。序列对比显示,该基因编码蛋白的氨基酸在不同的植物物种中存在较高的保守性。半定量RT-PCR分析结果显示,毛果杨环化酶基因Potri.006G237100在木质部、叶柄、根组织中高丰度表达,且其转录水平与茎木质化程度同步。构建Potri.006G237100-GFP融合的植物载体,在拟南芥中过量表达Potri.006G237100-GFP,用激光共聚焦显微镜检测转基因拟南芥根中GFP荧光信号,结果显示信号集中细胞质内,在周质区域也有少量信号分布,表明Potri.006G237100蛋白可能定位在细胞质。通过转化拟南芥获得Potri.006G237100过量表达遗传材料,组织解剖学结合化学染色分析显示,与野生型相比过表达Potri.006G237100基因拟南芥材料出现木质部细胞不规整、束间细胞壁增厚;过表达Potri.006G237100基因拟南芥材料的根长与野生型拟南芥根长相比变长。这些结果表明环化酶基因Potri.006G237100可能参与杨树木材(次生细胞壁)形成。

关键词：毛果杨 Portri.006G237100 环化酶载体构建转基因拟南芥

Jadomycin B合成环化酶JadD、JadI的基因敲除及天蓝色链霉菌膜蛋白质组分析

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Jadomycin B合成环化酶JadD、JadI的基因敲除及天蓝色链霉菌膜蛋...

作者：石宣明四川农业大学

学位级别：硕士

第一部分 Jadomycin B环化酶JadD、JadI的基因敲除 jadomycin B是角环聚酮化合物的代表,具有抑制革兰氏阳性菌、酵母及肿瘤生长的活性,合成聚酮主链的聚酮合酶属Ⅱ型PKS。自1994年Han等人利用actI作为探针克隆到jadomycin B的聚酮... 详细信息

第一部分 Jadomycin B环化酶JadD、JadI的基因敲除 jadomycin B是角环聚酮化合物的代表,具有抑制革兰氏阳性菌、酵母及肿瘤生长的活性,合成聚酮主链的聚酮合酶属Ⅱ型PKS。自1994年Han等人利用actI作为探针克隆到jadomycin B的聚酮碳链合成的基因簇后,从分子生物学角度研究jadomycin B的生物合成的机理陆续展开。不同的芳香聚酮的环数、成环的位置和方向不一样,以jadomycin B为代表的角环聚酮化合物的环化机理的研究对探索合成新的聚酮化合物具有重大的理论意义。目前对jadomycin B生物合成环化酶的研究主要在两个方面:序列分析和异源表达。前者表明jadomycin基因簇中有两个环化酶,分别是JadD和JadI;而其异源表达表明JadD可能参与jadomycin B的第一环(D)的环化,JadI可能参与后续的环化作用,因为在含jadI的基因和PKS基因的异源表达时发现了角环中间物UWM6的生成,但未分离到这两个环化酶的的作用底物,也未得到在野生型菌株内相关的功能证据。本研究用双交换插入失活的方法对委内瑞拉链霉菌角蒽环聚酮化合物jadomycin B环化酶JadD、JadI进行基因敲除,获得三个突变株,并尝试提取突变株积累的中间代谢物。对于JadD,缺失其基因jadD起始密码子和终密码子间777bp,替换为带有正向启动子的998bp卡那霉素抗性基因kan,构建了jadD的基因敲除突变株jadD::kan(VS210)。对于JadI,缺失其基因jadI起始密码子和终密码子间273bp,分别替换为带有正、反向启动子的998bp卡那霉素抗性基因kan,构建了jadI的基因敲除突变株jadI::kan(VS212,VS213)。对突变株进行发酵,分离提取主要中间代谢物,用HPLC和LC-MS/MS分析表明:三个突变株VS210,VS212和VS213均不产角蒽环类聚酮化合物jadomycin B,证实了JadD和JadI是jadomycin B生物合成中的关键酶,但没有发现可能为相应环化酶作用底物的中间代谢物。用相应的环化酶重组表达载体对突变株进行互补实验,也不能恢复其产jadomycin B的功能。上述实验结果表明,VS210、VS212和VS213中的相应环化酶基因的双交换kan插入失活影响了下游基因的表达。

关键词：委内瑞拉链霉菌双交换插入失活 jadomycin B 环化酶 HPLC 天蓝色链霉菌多维蛋白质鉴别技术膜蛋白组质谱拓扑学

腺苷环化酶的细胞化学定位研究(光学显微镜和电子显微镜):事实和假像

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解剖学报 1980年第3期 289-298,340-341页

作者：赵孟莲高燕汪堃仁徐卫应芸书吴连英张锦珠刘孔林北京市肿瘤研究所细胞生物室中国科学院生物物理所

本工作对大鼠肾及小鼠十二指肠等进行了光学显微镜下腺苷环化酶的细胞化学研究;并在大鼠肾、颌下腺及肝等组织进行了电镜细胞化学定位的观察。采用ATP和特异性底物AMP-PNP显示腺苷环化酶的活性。实验结果表明:(1)温育在含有和不含有底... 详细信息

本工作对大鼠肾及小鼠十二指肠等进行了光学显微镜下腺苷环化酶的细胞化学研究;并在大鼠肾、颌下腺及肝等组织进行了电镜细胞化学定位的观察。采用ATP和特异性底物AMP-PNP显示腺苷环化酶的活性。实验结果表明:(1)温育在含有和不含有底物的孵育液中,电镜下均观察到在组织的相同部位呈现出黑色电子密度沉淀,这种沉淀物的出现对戊二醛固定较为敏感。光学显微镜下,经不加底物的孵育液温育的切片均为阴性反应。(2)孵育液内加入腺苷环化酶的激活剂(氟化钠)或抑制剂(四氧嘧啶),其反应沉淀物的出现均无明显变化。(3)在碱性磷酸酶含量较高的组织(肾、十二指肠)中,以AMP-PNP为底物,在光学显微镜下观察到有碱性磷酸酶反应的干扰。(4)组织小块或冰冻切片经煮沸加热处理后,在光学显微镜和电镜下均不出现沉淀物。我们的实验结果进一步对R-H氏显示腺苷环化酶的细胞化学方法的有效估价表示怀疑。

关键词：光学显微镜底物环化酶裂合酶孵育液反应 PNP 细胞化学鼠肾温育纹状缘电镜电子显微镜

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硒对肝癌及正常肝的不同生化效应——Ⅱ、亚硒酸钠对环-磷腺苷环化酶及磷酸二酯酶活性的影响

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肿瘤防治研究 1983年第1期 16-18+26页

作者：王黎明于树玉中国医学科学院肿瘤研究所

本文的体内实验表明亚硒酸钠具有选择性的抑制HA肝癌细胞内环磷腺苷二酯酶的活性,但对环化酶无影响。酶动力学的测定,表明正常肝和肝癌宿主肝中PDE的km值相同,而与肝癌者不同,提示PDE同工酶在组成上或细微结构上可能有某些差异而造成了... 详细信息

本文的体内实验表明亚硒酸钠具有选择性的抑制HA肝癌细胞内环磷腺苷二酯酶的活性,但对环化酶无影响。酶动力学的测定,表明正常肝和肝癌宿主肝中PDE的km值相同,而与肝癌者不同,提示PDE同工酶在组成上或细微结构上可能有某些差异而造成了对亚硒酸钠的反应性不同。

关键词：肝癌细胞环化酶裂合酶亚硒酸钠

显示腺苷环化酶的细胞化学技术方法的建立和发展

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细胞生物学杂志 1982年第1期 19-22页

作者：赵孟莲北京市肿瘤防治研究所

腺苷环化酶(Adenylate cyclase)存在于多种细胞膜中,某些激素系通过刺激膜上的腺苷环化酶而使 ATP 生成 cAMP。细胞内cAMP 水平,常是由腺苷环化酶所调节的。采用生物化学方法进行腺苷环化酶的研究,已提供了该酶在许多组织中的定量资料... 详细信息

腺苷环化酶(Adenylate cyclase)存在于多种细胞膜中,某些激素系通过刺激膜上的腺苷环化酶而使 ATP 生成 cAMP。细胞内cAMP 水平,常是由腺苷环化酶所调节的。采用生物化学方法进行腺苷环化酶的研究,已提供了该酶在许多组织中的定量资料。但是,由于生化测定方法不易区分酶活性是某种细胞或

关键词：孵育液 PNP 酶水解环化酶裂合酶温育细胞化学 AMP 组织细胞 ATP 底物硝酸铅硝酸盐

头孢菌素C产生菌顶头孢霉菌的环化酶和扩环酶的活力水平

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国外药学(抗生素分册) 1987年第4期 264-266页

作者：王力

头孢菌素 C 的生物合成途径如图1所示。虽然对前面的2步反应了解甚微,但其余生物合成途径的酶已在许多实验室中研究。顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)最关键的调节酶是 Docpc 合成酶(扩环酶),也就是能催化青霉素 N 扩环的双氧酶... 详细信息

头孢菌素 C 的生物合成途径如图1所示。虽然对前面的2步反应了解甚微,但其余生物合成途径的酶已在许多实验室中研究。顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)最关键的调节酶是 Docpc 合成酶(扩环酶),也就是能催化青霉素 N 扩环的双氧酶。此酶存在一个受碳源和氮源阻遏的位点。以往对顶头孢霉菌生物合成的研究是借助于低产菌株

关键词：扩环酶霉菌产生菌头抱菌素环化酶裂合酶

利用产黄青霉和产黄小枝顶孢环化酶合成青霉素G

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国外医药(抗生素分册) 1987年第4期 262-263+266页

作者： J.M.Luengo 张惠荪

δ(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸(ACV)的三肽结构是青霉素、头孢菌素和头霉素生物合成途径中的一种中间产物(图1)。它似乎是由三种氨基酸即α-氨基乙二酸、半胱氨酸和缬氨酸组成的一种非核蛋白体的缩合作用生成的。上述三... 详细信息

δ(L-α-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰基-D-缬氨酸(ACV)的三肽结构是青霉素、头孢菌素和头霉素生物合成途径中的一种中间产物(图1)。它似乎是由三种氨基酸即α-氨基乙二酸、半胱氨酸和缬氨酸组成的一种非核蛋白体的缩合作用生成的。上述三种组份氨基酸再通过异青霉素 N 合成酶(即所谓环化酶)被环化成异青霉素 N。这种具有抗菌活力的化合物(异青霉素 N)的酶法合成的成功促使对几种与 ACV 有类似结构的肽之环化作用进行更广泛深入的研究,以期获得结构有所改良、抗菌谱有所改进的某些青霉素。

关键词：青霉素合成酶 ACV 抗菌素连接酶产黄青霉 PCV 裂合酶环化酶小枝

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北京鸭红细胞膜腺苷酸环化酶的测定

科学通报 1981年第20期26卷 1272-1275页

作者：张德昌吴亭张志荣安岩高海泉时其煌中国医学科学院基础医学研究所北京公安医院

腺苷酸环化酶(Adenylate Cyclase EC 4,6,1,1)催化ATP转化为Cyclic AMP(cAMP)。而cAMP是多种激素和神经介质发挥细胞内作用的信息物质。激素或神经介质首先与细胞表面的受点结合,改变与受点偶联的腺苷酸环化酶(AC)活性,从而改变细胞内的... 详细信息

腺苷酸环化酶(Adenylate Cyclase EC 4,6,1,1)催化ATP转化为Cyclic AMP(cAMP)。而cAMP是多种激素和神经介质发挥细胞内作用的信息物质。激素或神经介质首先与细胞表面的受点结合,改变与受点偶联的腺苷酸环化酶(AC)活性,从而改变细胞内的cAMP浓度,以调节细胞的代谢和其它功能的活动。因此,受点——AC系统被认为是一种极为重要的生物信息体系。

关键词：北京鸭环化酶激素神经介质 AC 裂合酶红细胞膜肾上腺素能药物火鸡 NaF