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拟南芥水苏糖合成酶基因（AtSTS）的克隆及其对玉米的遗传转化

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拟南芥水苏糖合成酶基因（AtSTS）的克隆及其对玉米的遗传转化

作者：李旭东西北农林科技大学

学位级别：硕士

种子活力直接关系到种子萌发和粮食产量。棉子糖系列寡糖(Raffinose family oligosaccharides,RFOs)在种子活力建成及抵御非生物胁迫过程中发挥重要作用。水苏糖和毛蕊花糖作为RFOs代谢通路中的髙聚棉子糖(HDP-RFOs)仅存在于部分植物中... 详细信息

种子活力直接关系到种子萌发和粮食产量。棉子糖系列寡糖(Raffinose family oligosaccharides,RFOs)在种子活力建成及抵御非生物胁迫过程中发挥重要作用。水苏糖和毛蕊花糖作为RFOs代谢通路中的髙聚棉子糖(HDP-RFOs)仅存在于部分植物中。已有研究表明HDP-RFOs在拟南芥种子活力建成中发挥重要作用。玉米种子中不存在HDP-RFOs,其相关合成酶基因可能在进化或驯化过程中发生了丢失。本实验克隆了拟南芥HDP-RFOs合成酶基因AtSTS(Stachyose synthase,STS),并构建了玉米表达载体,通过农杆菌转化方法,获得了玉米转基因植株。主要研究结果如下:(1)从Columbia-0野生型拟南芥种子中克隆得到拟南芥水苏糖合成酶基因(AtSTS,At4g01970)并构建了原核表达载体,对其原核表达产物进行酶活检测发现其具有水苏糖合成酶活性。(2)对AtSTS原核表达蛋白产物纯化回收,进行家兔免疫,4次免疫后,进行多克隆抗体效价检测,可检测蛋白浓度最低至10 ng。(3)对本实验室已有的AtSTS拟南芥转化株系叶片糖组分进行检测发现,野生型并无水苏糖,而过表达AtSTS植株的叶片中水苏糖大量积累。(4)获得了7株AtSTS玉米超表达植株。利用农杆菌将AtSTS成功转入A188玉米幼胚,经PPT筛选得到抗性愈伤组织,再生后得到7株阳性转化苗。发现AtSTS基因在RNA水平、蛋白水平得到高效表达。糖组分检测发现T0代玉米叶片中水苏糖大量积累。本研究成功获得了可育的玉米AtSTS转基因植株,这些转基因植株对于研究能否利用HDP-RFOs提高玉米种子活力及其耐贮性具有重要意义。

关键词：玉米水苏糖合成酶种子活力玉米遗传转化

大麦Isa-H1基因在玉米中遗传转化的研究

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大麦Isa-H1基因在玉米中遗传转化的研究

作者：李颖吉林大学

学位级别：硕士

玉米是重要的粮食作物之一。玉米成熟期存在一种灾害,即遇到阴雨天气,穗上发芽,称之为穗发芽(PHS)。穗发芽能够导致玉米品质下降。大麦α-淀粉酶抑蛋白(BASI),可有效抑制α-淀粉酶活性,在小麦遗传背景中表达可改善淀粉品质和增加穗发芽... 详细信息

玉米是重要的粮食作物之一。玉米成熟期存在一种灾害,即遇到阴雨天气,穗上发芽,称之为穗发芽(PHS)。穗发芽能够导致玉米品质下降。大麦α-淀粉酶抑蛋白(BASI),可有效抑制α-淀粉酶活性,在小麦遗传背景中表达可改善淀粉品质和增加穗发芽抗性。所以本研究克隆了α-淀粉酶抑制蛋白基因Isa-H1和大麦胚乳特异启动子Horp,构建了植物高效表达载体pHorp-Isa-H1。建立了稳定的遗传转化体系,并通过农杆菌介导和花粉管转化的方法将其转入骨干玉米自交系。取得进展如下: 用PCR方法扩增Horp和Isa-H1全长,测序后将Horp、Isa-H1连接到切除35S和GUS基因的pCAMBIA3301载体上,最后获得植物表达载体pHorp-Isa-H1。在玉米遗传转化中,由于基因型限制,作为转化受体的自交系较少。本实验从40个玉米自交系中筛选出优良玉米自交系Y412、Y423作为受体材料。发现这两个材料的幼胚均可大量高效的诱导出玉米体细胞胚胎,而且诱导出的体胚能够长时间继代无限繁殖,无外源激素调控就可两极同时分化以及分化率和成苗率极高等特点。将构建好的植物表达载体pHorp-Isa-H1转化到农杆菌EHA105中,对玉米愈伤进行转化,PPT筛选抗性愈伤并分化成苗。对抗性植株进行了PCR分子检测,获得了13株转基因植株。在转化受体系统选择时,发现玉米的茎节,离体培养具有双极性,能够快速成长为完整植株。随机选取了5个优良玉米自交系,对其进行了重复试验,结果证明此方法不存在基因型限制,转化周期也大大缩短,为玉米的遗传转化提供了一个新的受体系统。实验还直接对玉米的幼胚进行了转化试验。选取2个玉米自交系的幼胚,进行农杆菌侵染,结果发现这种方法简便易行,抗性苗成苗率高,克服了玉米遗传转化过程中基因型障碍问题,加快了玉米转基因研究进程。利用花粉管通道法介导的遗传转化体系,将构建好的植物表达载体pHorp- Isa-H1转入玉米自交系,并成功获得了12株T0代转基因植株。将T0代种子以穗为单位收获后,提取了T1代胚乳DNA进行了PCR检测,结果显示,55%的T1种子都含有外源的目的基因,目前已获得T2代种子。

关键词：玉米遗传转化 Isa-H1 农杆菌介导花粉管通道

比较3种方法制备的农杆菌侵染玉米自交系‘B 104’幼胚的效率

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中国农业大学学报 2022年第3期27卷 11-17页

作者：冯鑫磊李结平河南大学生命科学学院/省部共建作物逆境适应与改良国家重点实验室/棉花生物学国家重点实验室河南开封475004

为探究提高农杆菌侵染效率的最优制备方法,以玉米自交系‘B 104’为转化受体,分析比较YEP固体和液体培养基,AB液体培养基制备的农杆菌EHA 105(植物双元表达载体pCAMBIA 3301)瞬时侵染幼胚能力的差异。结果表明,AB液体培养基制备的农杆... 详细信息

为探究提高农杆菌侵染效率的最优制备方法,以玉米自交系‘B 104’为转化受体,分析比较YEP固体和液体培养基,AB液体培养基制备的农杆菌EHA 105(植物双元表达载体pCAMBIA 3301)瞬时侵染幼胚能力的差异。结果表明,AB液体培养基制备的农杆菌瞬时侵染率达到100%,染色面积超过30%的幼胚占比约为40%,显著高于YEP培养基制备的农杆菌(P转化苗阳性转化率显著高于YEP液体培养基的阳性转化率(P转化率,获得了更多的胚性愈伤,保障了较高的阳性遗传转化率,优化了玉米自交系‘B 104’遗传转化技术体系。

关键词：玉米遗传转化 YEP培养基 AB液体培养基瞬时侵染率

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玉米ZmCYP72A5基因的功能研究

玉米ZmCYP72A5基因的功能研究

作者：张文婷山东农业大学

学位级别：硕士

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是一类古老的血红素硫蛋白的超家族基因,广泛存在于动植物、细菌、真菌等物种的细胞内,参与了生物生长发育过程中多种物质的合成与代谢。研究表明CYP450氧化酶家族基因在植物的抗虫、抗除草剂等抗... 详细信息

细胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)是一类古老的血红素硫蛋白的超家族基因,广泛存在于动植物、细菌、真菌等物种的细胞内,参与了生物生长发育过程中多种物质的合成与代谢。研究表明CYP450氧化酶家族基因在植物的抗虫、抗除草剂等抗性方面具有重要的调控作用,但在玉米(Zea mays L.)发育调控中的作用并不清楚。本研究通过基因编辑技术造成玉米ZmCYP72A5基因的缺失进而研究其在玉米生长发育中的功能。主要结果如下:玉米ZmCYP72A5基因位于3号染色体上,基因全长1853 bp,其中编码区1581 bp,共编码526个氨基酸。结构域分析结果显示,ZmCYP72A5在N端含有一个跨膜结构域和一个高度保守的P450超家族结构域,包含的氧结合活性区、PERF区和亚铁血红素结合区三个区域为P450超家族特有的功能结构域。进化树分析发现,玉米CYP72A5与其它植物的CYP72A同源蛋白有不同程度上的亲缘关系,与单子叶植物的CYP72A同源性较高,且与高粱CYP72A15的亲缘关系最近,与双子叶植物的亲缘关系较远。ZmCYP72A5蛋白在玉米原生质体中的亚细胞定位结果显示,该蛋白定位于内质网膜上。qRT-PCR结果表明,ZmCYP72A5在各个组织和器官中有不同程度的表达,但在幼根和叶中表达水平较高,尤其是授粉后的叶片中表达量高,其他部位的表达量则很低。为了研究ZmCYP72A5基因在玉米中的生物学功能,我们构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体,以玉米自交系Q319为受体材料,进行农杆菌介导的玉米遗传转化实验并获得该基因被编辑的转基因株系(ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9)。结果表明,与对照相比,ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9转基因植株株高变矮,平均株高降低约10 cm,雌穗穗位高度相应随之降低,但植株总的节间数并没有发生变化。解剖学观察结果表明,ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9植株的第9至11节间和节间细胞长度较对照明显缩短。ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9植株的抽穗时间与对照相比延迟2-5天。同时观察并统计从播种至作物完熟时的生育期,该基因敲除的株系的生育期明显比对照株系延长。两种材料前期叶绿素含量差异不明显,授粉20天后差异开始显著。与野生型相比,ZmCYP72A5-CRISPR/Cas9植株叶片持绿时间较长。转基因株系的光合速率比对照株系低,在同一时期,转基因株系的叶片衰老标志基因ZmSEE1的表达量比对照株系中的低。总之,敲除了ZmCYP72A5基因的转基因株系持绿时间延长,叶片衰老缓慢,生育期增加。为了检测敲除转基因株系的产量是否受影响,我们对各转基因株系授粉后不同时间的种子的百粒鲜重以及收获后的干种子百粒重进行统计比较。结果显示,前期阶段种子中干物质的积累量相对于对照株系积累速度较慢,但由于其生育期的延长,最终弥补了前期干物质的积累缓慢,所以最终的百粒重没有因此而减少,维持住了产量。综上所述,对ZmCYP72A5缺失表达的转基因植株分析表明,该基因参与了玉米发育相关的调控,转基因植株株高变矮、生长缓慢、生育期延长,但产量不变。而且转基因植株所表现出的性状对于利用转基因手段培育玉米高产品系具有较高的应用价值。

关键词：玉米抽穗时间细胞色素P450氧化酶 Zm CYP72A5 玉米遗传转化 CRISPR/Cas9

超声波辅助细胞穿透多肽介导的花粉遗传转化技术的研究

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超声波辅助细胞穿透多肽介导的花粉遗传转化技术的研究

作者：韩凯西北农林科技大学

学位级别：硕士

自世界上首例转基因烟草问世以来,植物转基因技术得到广泛应用,特别是在作物育种方面。尽管在过去的几年中玉米的转化技术取得了较大进展,但对研究者来说遗传转化技术仍然是玉米转基因研究的一个关键限制因素。目前常用的方法是基因枪... 详细信息

自世界上首例转基因烟草问世以来,植物转基因技术得到广泛应用,特别是在作物育种方面。尽管在过去的几年中玉米的转化技术取得了较大进展,但对研究者来说遗传转化技术仍然是玉米转基因研究的一个关键限制因素。目前常用的方法是基因枪法和农杆菌介导法。因此需开发一种新的遗传转化方法,建立稳定、便捷和高效的遗传转化,加速作物新品种培育的步伐和功能基因组学研究的发展。应用细胞穿透多肽(cell penetrate peptides,CPPs)为介导对花粉进行的转基因研究,无需大量准备工作,从收集花粉到完成遗传转化可在几小时内完成。本文就超声处理参数、植物表达载体构建、转基因植株草甘膦筛选浓度及转基因检测等方面做了相关研究。主要研究结果如下:1.以玉米自交系昌7-2为材料,利用TTC染色法和花粉离体萌发的方法研究了不同培养基组分和不同超声参数对花粉活力的影响。结果表明:花粉在液体中的活力急剧下降;随着超声处理强度的加大,花粉的活力明显降低;相同超声强度下,超声处理时间越长,花粉的活力越低。SAS软件分析表明在四种不同的培养基中,PLM1和PLM3对花粉活力的影响相对小一些。不同超声处理对花粉活力的影响:N1玉米谷氨酰胺合成酶基因(GS1)插入pCUbi1390载体的Ubi启动子后面PstI酶切位点处,然后在此基础之上,再将选择标记基因5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因( CaMV35S + EPSPS )插入HindIII位点,构建植物表达载体pCUbi1390-Ubi-GS1-35S-EPSPS。结果表明In-Fusion法正确构建了设计的转化载体,简化了载体构建的过程,也适用于任何一个基于单酶切位点把外源DNA重组插入目标序列,具有应用与推广价值。3.以玉米自交系18-599(红)为材料,当幼苗4-5叶时,分别喷施不同浓度的草甘膦溶液,确定转基因植株草甘膦筛选浓度。幼苗在喷施0.2%的草甘膦一周后死亡77株,受抑制163株,正常9株,96.4%的非转基因玉米苗对0.2%的草甘膦没有抗性。因此,选用0.2%的草甘膦药液作为筛选转基因植株的最适浓度。4.以玉美头168为材料,5%的蔗糖溶液为超声处理缓冲液进行花粉介导的遗传转化实验。收获种子后,对T0代进行PCR检测、Elisa检测试验。利用不同超声波处理参数处理花粉,授粉后总共得到种子467粒,将种子种到温室里共出苗432株,经过三轮的PCR检测,共有23株幼苗为转基因植株。PCR检测转基因效率约为5.32%。对可以正常结实的18株PCR检测阳性的转基因植株进行Elisa检测,18个单株全部呈现阳性。进一步转基因检测得到的转基因效率为4.17%。

关键词：玉米遗传转化花粉介导法细胞穿透多肽超声处理转基因检测