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动物医学进展 2022年第1期43卷 38-45页

作者：任丽君杨孝朴包世俊武小椿马永华魏衍全甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

旨在克隆到猫ω干扰素和γ干扰素(FeIFN-ω和FeIFN-γ)基因的基础上,分析它们的一些生物学特性,并进行可溶性原核表达和简化纯化工艺,为后期作为抗病毒药物的开发奠定基础。根据GenBank登录的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因序列,对其编码氨基... 详细信息

旨在克隆到猫ω干扰素和γ干扰素(FeIFN-ω和FeIFN-γ)基因的基础上,分析它们的一些生物学特性,并进行可溶性原核表达和简化纯化工艺,为后期作为抗病毒药物的开发奠定基础。根据GenBank登录的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因序列,对其编码氨基酸的信号肽序列进行分析,设计引物用于克隆不包含信号肽的成熟蛋白基因序列,分别插入到原核表达载体pET28a-SUMO,转化入BL21感受态细胞进行表达,并通过不同的诱导时间、温度和控制IPTG浓度优化其表达条件,在纯化阶段摸索简易工艺。结果表明,FeIFN-ω基因编码区长591 bp,共编码196个氨基酸,信号肽序列为前23位氨基酸;FeIFN-γ基因编码区长504 bp,共编码167个氨基酸,信号肽序列为前20位氨基酸。将克隆到的FeIFN-ω和FeIFN-γ基因通过Bam HⅠ和Hin dⅢ酶切位点带入到含SUMO标签的原核表达载体,构建成功的重组质粒分别命名为pET28a-SUMO-FeIFN-ω和pET28a-SUMO-FeIFN-γ。优化条件后表明SUMO-FeIFN-ω融合蛋白在IPTG终浓度为0.6 mmol/L时,16℃诱导6 h表达量最高;SUMO-FeIFN-γ融合蛋白在IPTG终浓度为0.8 mmol/L时,16℃诱导9 h表达量最高。最终表达出均以可溶性形式存在的两种融合蛋白,经镍柱纯化,用SUMO蛋白酶去除标签和经两次截留柱纯化获得不含标签的干扰素,分子质量约18 ku和17 ku,与预期大小相符,表明FeIFN-ω和FeIFN-γ蛋白成功得到表达和纯化。

关键词：猫ω干扰素猫γ干扰素可溶性表达蛋白纯化

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增强型猫ω干扰素的筛选及抗病毒活性分析

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中国预防兽医学报 2022年第2期44卷 195-201,213页

作者：李茵潘玉迪田进曲连东中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为获得增强型猫ω干扰素(FeIFN-ω),本研究通过分子对接方法预测和参考相关位点研究,设计3组定点突变引物。以pJET-FeIFN-ω为模板分别扩增FeIFN-ω基因及其3个突变基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并连接慢病毒载... 详细信息

为获得增强型猫ω干扰素(FeIFN-ω),本研究通过分子对接方法预测和参考相关位点研究,设计3组定点突变引物。以pJET-FeIFN-ω为模板分别扩增FeIFN-ω基因及其3个突变基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并连接慢病毒载体pLVX-IRSE,构建重组质粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、p LVX-FeIFN-ω-T188R。4个重组质粒分别与包装质粒psPAX2和膜蛋白质粒pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,48 h后收获细胞上清即为慢病毒。分别将4个慢病毒转导293悬浮细胞(293s),扩大培养后收获细胞上清,经镍离子亲和层析柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE检测、BCA法测蛋白浓度。结果显示,rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R在293s细胞中得到高效表达,且蛋白纯化效果好;经BCA法测浓度,4种重组蛋白浓度均约为200μg/mL,即获得了重组干扰素rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。4种重组干扰素分别经猫肾细胞(CRFK)孵育18 h后接种猫杯状病毒(FCV)或猫疱疹病毒(FHV)12 h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素抗FCV和FHV活性;4种重组干扰素分别经CRFK细胞孵育12 h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1的转录水平,结果显示:实验组与空白对照组差异极显著(P0.05)或表现为活性降低,rFeIFN-ω-T188R与rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R差异均显著(P干扰素受体(IFNAR1/R2)的重组质粒转染293T细胞的裂解液,4℃结合过夜,经western blot鉴定干扰素与IFNAR1/R2结合亲和力分析,结果显示,rFeIFN-ω-T188R与IFNAR1的结合能力比r FeIFN-ω高1倍左右,且两者与IFNAR2的结合能力差异不显著。本研究成功筛选到增强型rFeIFN-ω-T188R,为研究高效FeIFN-ω药物奠定了基础。

关键词：猫ω干扰素真核表达生物活性

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猫ω干扰素研究进展

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中国兽药杂志 2018年第12期52卷 69-74页

作者：孙明洁董国英张雪竹胡桂学吉林农业大学动物科学技术学院长春130118 北京师范大学全球变化与地球系统科学研究院北京100875

猫ω干扰素因其较高的抗病毒、抗增殖和抗肿瘤效果以及免疫调节作用引起广泛关注与研究。结合ω干扰素相关研究结果,综述猫ω干扰素的结构特征、生物学活性以及抗病毒的作用机制,综合分析其在临床上对FCV、FHV-1、FIV、FCGS及FIP等几种... 详细信息

猫ω干扰素因其较高的抗病毒、抗增殖和抗肿瘤效果以及免疫调节作用引起广泛关注与研究。结合ω干扰素相关研究结果,综述猫ω干扰素的结构特征、生物学活性以及抗病毒的作用机制,综合分析其在临床上对FCV、FHV-1、FIV、FCGS及FIP等几种常见猫病毒病的治疗效果,以期为临床上寻求新型有效的动物抗病毒药物提供参考。

关键词：猫ω干扰素抗病毒活性作用机制临床应用

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增强型猫ω干扰素的制备及生物学活性分析

增强型猫ω干扰素的制备及生物学活性分析

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作者：李茵中国农业科学院

学位级别：硕士

猫ω干扰素(FeIFN-ω)属于I型IFN,主要由白细胞产生,具有广谱抗病毒、抗细胞增殖活性。重组猫ω干扰素(rFeIFN-ω)是第一个被批准用于治疗猫病毒性疾病和肿瘤性疾病的干扰素制剂。rFeIFN-ω在治疗某些病毒感染疾病方面的疗效优于IFN-α... 详细信息

猫ω干扰素(FeIFN-ω)属于I型IFN,主要由白细胞产生,具有广谱抗病毒、抗细胞增殖活性。重组猫ω干扰素(rFeIFN-ω)是第一个被批准用于治疗猫病毒性疾病和肿瘤性疾病的干扰素制剂。rFeIFN-ω在治疗某些病毒感染疾病方面的疗效优于IFN-α,具有良好的应用前景。目前,我国宠物猫饲养量激增,有效疫苗和治疗药品缺乏,尤其是商品用猫ω干扰素严重缺乏,因此加速猫用生物制剂的研发进程势在必行。为了研制具有高活性的rFeIFN-ω,本研究首先通过原核表达系统制备rFeIFN-ω,利用PCR扩增FeIFN-ω成熟蛋白区,构建重组质粒pET-SUMO-FeIFN-ω,在大肠杆菌BL21(DE)感受态细胞中可溶性表达了重组蛋白rFeIFN-ω,SDS-PAGE结果显示rFeIFN-ω在20℃诱导条件下蛋白表达量较高且杂蛋白相对较少;亲和层析纯化蛋白,产量达到50 mg/100 m L。在猫肾细胞(CRFK)上对原核表达rFeIFN-ω进行抗病毒活性分析,结果显示rFeIFN-ω对猫杯状病毒(FCV)有一定的抑制作用。然后利用293悬浮细胞(293s)结合慢病毒包装方法对rFeIFN-ω进行真核表达。将FeIFN-ω全基因克隆至慢病毒载体,构建重组质粒pLVX-FeIFN-ω,在293T细胞中包装慢病毒,收获的病毒上清转导293s细胞大量表达目的蛋白,收集细胞上清进行亲和层析,结果显示rFeIFN-ω蛋白产量为19 mg/100 m L。为了比较原核和真核表达rFeIFN-ω的生物学活性,在CRFK细胞上检测rFeIFN-ω抑制FCV复制的能力和双荧光素酶试验分析rFeIFN-ω对干扰素刺激反应元件(ISRE)的激活能力。结果显示真核表达rFeIFN-ω抗病毒活性及ISRE启动子激活能力均高于原核表达。在此基础上,通过分子对接技术对FeIFN-ω氨基酸序列进行突变改造,获得3条突变后的基因序列FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R。在293T细胞中包装慢病毒后转导293s细胞,表达重组蛋白rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R,纯化后蛋白产量分别为:35 mg/100 m L、24 mg/100 m L、22 mg/100 m L。随后比较野生型及突变型rFeIFN-ω体外抗FCV、猫疱疹病毒(FHV)和猫冠状病毒(FCo V)复制能力及激活干扰素刺激基因(ISGs)表达能力,结果显示rFeIFN-ω-T188R的体外抗病毒活性和激活ISGs表达活性均最高;进一步研究结果显示,rFeIFN-ω-T188R与干扰素受体(IFNAR1/2)结合亲和力强于野生型rFeIFN-ω。最后比较rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-T188R和商品化重组猫ω干扰素体外抗FCV活性,结果显示rFeIFN-ω-T188R的抗病毒活性强于商品化重组猫ω干扰素。综上,本研究获得可溶性原核表达和真核表达的rFeIFN-ω蛋白,且真核表达产物生物学活性优于原核。FeIFN-ω的188位氨基酸是影响其生物学活性的关键氨基酸位点,将其突变为精氨酸后蛋白活性明显提高,体外试验表明增强型的rFeIFN-ω-T188R较高的抗病毒活性,为研发新型、高效的抗病毒干扰素药物提供了依据。

关键词：猫ω干扰素增强型重组真核表达系统抗病毒活性

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GC376、GS-441524、猫ω干扰素对猫传染性腹膜炎的治疗效果观察

GC376、GS-441524、猫ω干扰素对猫传染性腹膜炎的治疗效果观察

引用

作者：王俊杰东北农业大学

学位级别：硕士

猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)引起的一种慢性、全身性、致死性疾病,因其病原的特殊性,缺乏有效的预防手段,严重威胁猫的生命健康,给动物主人... 详细信息

猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)引起的一种慢性、全身性、致死性疾病,因其病原的特殊性,缺乏有效的预防手段,严重威胁猫的生命健康,给动物主人带来诸多困扰。目前国内现有的治疗方法基本采用对症治疗,没有具有针对性的治疗药物。近年来,国外研制开发了相应的药物,主要有GC376、GS-441524和猫ω干扰素(Feline interferon-omega,Fe IFN-ω)等,在试验研究中获得了较好的治疗效果,但对GS-441524与Fe IFN-ω的联合用药治疗效果没有相关的报道。目前上述三种药物尚未被引入国内,但近些年国内从科研机构获赠了该药物,但未能进行系统的临床验证。2021年1月份至2022年12月份北京某连锁动物医院收治自然感染的FIP患猫共156只,对患猫的年龄、性别、品种、体况评分、发病类型、临床症状、影像学检查结果和并发症发生情况进行统计,分析上述因素与发生FIP的相关性,总结FIP发病规律。将156只FIP患猫分为3组,具体治疗方法如下,GC376治疗组(376组):患猫31只,皮下注射GC37615 mg/kg,1次/12 h;GS-441524治疗组(441组):患猫98只,皮下注射GS-441524 7.5 mg/kg,1次/24 h;GS-441524与Fe IFN-ω联合治疗组(441+ω组):患猫27只,皮下注射GS-4415247.5 mg/kg,1次/24 h,在治疗开始的第一周与GS-441524同时皮下注射Fe IFN-ω40万IU/kg,1次/24 h;各组均根据患猫的情况采取相应的对症治疗,持续用药8周。记录各组患猫治疗前的血细胞分类计数检查结果(白细胞(White blood cell,WBC)、淋巴细胞(Lymphocyte,LYM)、淋巴细胞百分比(Lymphocyte percentage,LYM%)、红细胞(Red blood cell,RBC)、血红蛋白(Haemoglobin,HGB)和红细胞压积(Hematocrit,HCT))、血液生化指标(总蛋白(Total protein,TP)、白蛋白(Albumin,ALB)、球蛋白(Globulin,GLOB)、白球比(A:G)、淀粉酶(Amylase,AMY)和总胆红素(Total bilirubin,TBIL))和血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA)水平,并对上述指标进行跟踪监测,对比各组患猫治疗前与治疗后的血液指标变化,分析各组药物对上述血液指标的影响。跟踪监测治疗过程中各组患猫的临床状态和血液指标,统计分析各组药物的有效率,统计各组患猫的转归情况以及治疗周期,对比GC376、GS-441524、GS-441524与Fe IFN-ω联合应用的治疗效果。参与本试验的156只FIP患猫中,70.51%是幼龄猫,29.49%为成年猫。雄性猫就诊率远高于雌性猫,雄性和雌性的数量比为2:1。引进品种猫占比54.49%,略高于中华田园猫(45.51%)。渗出型发生率为62.82%,高于非渗出型(37.18%)。患猫初次就诊时体况评分多数在5分以下(80.13%)。临床症状以食欲不振(64.74%)、精神沉郁(57.69%)、发热(39.74%)和体重减轻(37.18%)为主。最常发的并发症是肝胆疾病(32.69%)和单纯性高胆红素血症(27.56%)。药物治疗8周后,FIP猫的临床症状均有明显改善,376组患猫的TP、TBIL显著降低,LYM、RBC、ALB显著升高;441组患猫的WBC、TP、GLOB、AMY、SAA显著降低,LYM、RBC、HGB、HCT、A:G显著升高;441+ω组患猫的TP、GLOB、AMY、SAA显著降低,RBC、HGB、HCT、A:G显著升高。441+ω组的有效率高于376组,差异显著(P猫的存活率没有显著差异。441组的用药时间少于376组,差异极显著(P<0.01);441+ω组的用药时间少于376组,差异极显著(P<0.01);441+ω组的用药时间少于441组,差异显著(P<0.05)。综合来看,GS-441524的治疗效果优于GC376;GS-441524与Fe IFN-ω联合应用的治疗效果优于单独使用GS-441524。为国内临床治疗FIP提供了用药参考和理论支持,为上述临床试验药物的引进和应用提供了依据。

关键词：猫传染性腹膜炎治疗 GC376 GS-441524 猫ω干扰素

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原核表达猫干扰素ω的纯化及其体外抗FPV活性检测

原核表达猫干扰素ω的纯化及其体外抗FPV活性检测

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作者：吴佳乐内蒙古农业大学

学位级别：硕士

为提高猫ω干扰素的表达量及获得高纯度fIFNω,本研究利用大肠杆菌表达系统实现fIFNω与Sumo标签融合表达,经IPTG诱导确认SUMO-fIFNω的表达形式。上清表达重组蛋白经金属离子螯合柱(Nie)的亲和层析、层析脱盐、SUMO酶的溶液酶切、Nie... 详细信息

为提高猫ω干扰素的表达量及获得高纯度fIFNω,本研究利用大肠杆菌表达系统实现fIFNω与Sumo标签融合表达,经IPTG诱导确认SUMO-fIFNω的表达形式。上清表达重组蛋白经金属离子螯合柱(Nie)的亲和层析、层析脱盐、SUMO酶的溶液酶切、Nie柱亲和穿透和Q柱层析等流程纯化。包涵体表达的重组蛋白变复性后使用与上清表达重组蛋白相同的流程纯化。纯化后的fIFNω经过质谱检测确认其分子量,并用F81细胞检测fIFNω对FPV的抗病毒活性。SUMO-fIFNω以上清和包涵体的形式表达。SDS-PAGE电泳验证SUMO-fIFNω分子量约为30k Da,经SUMO酶酶切后fIFNω分子量约为20k Da。优化出一种最佳SUMO酶酶切条件,为20m MTris,2M尿素,p H调至8.0,SUMO酶与蛋白的添加比为1:200(m:m)。包涵体表达的重组蛋白,使用20m M Tris,8M Urea,10m M DTT,p H 8.5变性,4℃复性效果最佳。纯化后的fIFNω经过质谱检测,分子量为19865.98k Da。纯化后的上清和包涵体表达fIFNω对FPV抗病毒活性测定结果分别为1280 IU/mg和1810 IU/mg。综上所述,基于本研究的技术路线,包涵体表达路线具有表达量高,纯化效果好,抗病毒活性高等优点,初步建立了fIFNω的表达、纯化和质量分析工艺,为后续产业化生产奠定了基础。

关键词：猫泛白细胞减少症猫ω干扰素表达纯化抗病毒活性

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