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猪链球菌2型Orf207基因缺失菌株的构建及其生物学特性检测

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微生物学通报 2023年第7期50卷 3009-3019页

作者：梅纪坤姜轩吴桐姜合祥朱俊辉武增帅李丰阳李娜雷连成吉林大学动物医学学院吉林长春130062

【背景】猪链球菌2型(streptococcus suis type 2, SS2)可引起人、猪的脑膜炎、关节炎及败血症等,不仅给养猪业带来巨大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。本团队前期通过噬菌体展示文库技术发现Orf207编码蛋白可能参与SS2诱导的脑... 详细信息

【背景】猪链球菌2型(streptococcus suis type 2, SS2)可引起人、猪的脑膜炎、关节炎及败血症等,不仅给养猪业带来巨大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。本团队前期通过噬菌体展示文库技术发现Orf207编码蛋白可能参与SS2诱导的脑膜炎发生,然而其在SS2致病过程中的具体作用尚不清楚。【目的】探究Orf207基因对SS2致病性的影响。【方法】采用温敏性自杀质粒介导的同源重组系统,构建SC19 Orf207基因缺失菌株ΔOrf207及其回补菌株CΔOrf207,系统比较缺失菌株与野生株间在生长特性、形态、组织定殖能力、毒力情况、细胞黏附与侵袭及抗巨噬细胞吞噬能力等生物学特性方面的差异。【结果】与野生株相比,缺失菌株链长变短,生长速度略慢;而且Orf207缺失显著增加了小鼠的存活率,降低了细菌在血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织的定殖能力和对肺组织的病理损伤并显著减弱SS2对HeLa细胞的黏附与侵袭能力及抗巨噬细胞吞噬能力。【结论】Orf207基因可以显著降低SS2对宿主的致病能力,本研究结果不仅丰富了SS2的致病机制,也为SS2疫苗等研发提供了新靶点。

关键词：猪链球菌2型 Orf207基因缺失株黏附侵袭

猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶介导细菌应激与致病作用

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微生物学通报 2024年第1期51卷 241-249页

作者：占冬波刘海发龙如意王占丰朱乐欣廖兵荣蒋小武宜春学院医学院江西宜春336000

【背景】硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TRR)是硫氧还蛋白系统关键组成部分,对病原菌应对体内外氧化应激、调节细菌稳态和介导致病过程具有重要作用。【目的】探究硫氧还蛋白还原酶TRR在人畜共患猪链球菌2型感染过程中参与的... 详细信息

【背景】硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TRR)是硫氧还蛋白系统关键组成部分,对病原菌应对体内外氧化应激、调节细菌稳态和介导致病过程具有重要作用。【目的】探究硫氧还蛋白还原酶TRR在人畜共患猪链球菌2型感染过程中参与的生物学效应。【方法】同源重组法构建猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶trr基因缺失株(Δtrr)及回补株(cΔtrr),通过细菌染色、点板计数、体外细胞和动物感染模型等试验比较分析trr基因对细菌形态、抗应激反应及致病过程的影响。【结果】缺失trr对猪链球菌2型形态与生长特性的影响不大,但可增强细菌抗热应激、氧化应激和酸应激能力,缺失株对上皮细胞黏附力下降,侵袭进入脑血管内皮细胞作用显著降低,易于被吞噬细胞吞噬清除,对小鼠模型致病效应显著减弱。【结论】猪链球菌2型TRR因子参与细菌应激反应,介导细菌黏附、侵袭等致病过程,是猪链球菌2型新的潜在毒力因子。

关键词：猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶应激反应致病作用

猪链球菌2型锌离子转运调控及其对致病性影响的研究

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猪链球菌2型锌离子转运调控及其对致病性影响的研究

作者：彭名正华中农业大学

学位级别：硕士

猪链球菌血清2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是一种重要的人畜共患病病原体,临床上分离率高,具有较强的致病性。它不仅给养猪业带来了巨大的经济损失,还可以感染人造成脑膜炎、关节炎及中毒样休克综合征等,严重威胁人类公共卫... 详细信息

猪链球菌血清2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是一种重要的人畜共患病病原体,临床上分离率高,具有较强的致病性。它不仅给养猪业带来了巨大的经济损失,还可以感染人造成脑膜炎、关节炎及中毒样休克综合征等,严重威胁人类公共卫生安全。锌是生物系统中第二丰富的过渡金属,可以作为辅因子参与细菌生理催化反应,也能影响中心碳代谢和肽聚糖生物合成,还与多种细菌的致病性相关,但锌在SS2中的功能及其作用机制尚不清楚。本课题通过生物信息学分析了SS2两个潜在的锌离子摄取蛋白SSUSC84＿0110(AdcA)和SSUSC84＿0296(Lmb),并探究其在SS2致病性方面发挥的功能,具体研究内容如下:1.猪链球菌2型AdcA和Lmb的生物信息学分析为了挖掘SS2基因组中与锌离子摄取相关的蛋白,本研究将不同革兰氏阳性菌中的锌摄取蛋白AdcA和Lmb与猪链球菌基因组进行氨基酸序列比对,结果发现猪链球菌SSUSC84＿0110蛋白与肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌中的AdcA同源蛋白氨基酸的相似性较高,分别为71%、60%、57%、38%。SSUSC84＿0296蛋白与肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、大肠杆菌Lmb同源蛋白的氨基酸的相似性分别为63%、58%、56%、24%。通过系统发生树分析猪链球菌SSUSC84＿0110与SSUSC84＿0296与其他革兰氏阳性菌中同源蛋白的聚类关系,发现肺炎链球菌中的AdcA和Lmb蛋白相似度最高。因此,我们将猪链球菌2型SSUSC84＿0110和SSUSC84＿0296蛋白分别命名为AdcA和Lmb。2.AdcA和Lmb在猪链球菌2型基础生物学功能研究为了研究猪链球菌2型AdcA和Lmb的功能,我们利用同源重组的方法构建了基因缺失菌株ΔadcA、Δlmb和ΔadcAΔlmb,并利用穿梭质粒p SET2构建了回补菌株CΔadcA和CΔlmb。通过革兰氏染色试验发现,与亲本株SC19(WT)相比,ΔadcAΔlmb的链长变长。通过扫描电镜发现,与WT相比,ΔadcAΔlmb链长变长,形状不规则,部分细胞分裂异常。通过生长曲线测定和活菌计数结果发现,与WT相比,ΔadcAΔlmb在正常TSB培养基中生长无显著差异。通过h BMEC细胞黏附和Hep-2细胞侵入试验发现,与WT相比,ΔadcAΔlmb黏附细胞和入侵细胞的能力显著下降。通过猪全血杀菌试验发现,与WT相比,ΔadcAΔlmb抵抗猪全血杀菌的能力显著下降。3.AdcA和Lmb在猪链球菌2型锌摄取中的功能研究为了研究AdcA和Lmb在猪链球菌2型锌摄取中的功能,参照之前的研究配制了化学合成培养基(CDM),通过qRT-PCR发现WT在限锌培养基中adcA和lmb基因的表达水平显著升高。通过比较突变株和野生株在不同锌离子浓度下的CDM培养基中的生长曲线,发现ΔadcAΔlmb在限锌培养基中生长明显减弱,而ΔadcA和Δlmb单基因突变株的生长能力与野生株相比无明显差异,只有在加入0.01 mmol/L锌离子时,ΔadcAΔlmb的生长能力才能恢复至野生菌株的水平,表明AdcA和Lmb在锌离子摄取方面具有协同作用。为了研究AdcA和Lmb在抵抗宿主营养免疫中的作用,通过比较突变株和野生株在添加不同浓度钙卫蛋白(CP)下的生长,与WT相比,ΔadcAΔlmb对钙卫蛋白的耐受性显著降低。通过对CP进行定点突变后,所有菌株的生长均无明显差异,表明CP中的锌离子结合位点具有抗菌活性。4.AdcA和Lmb在猪链球菌2型毒力中的功能研究通过小鼠模型评估了AdcA和Lmb在猪链球菌2型毒力中的功能。小鼠存活和组织载菌量试验表明,与WT相比,ΔadcAΔlmb感染后存活率为100%,感染48 h后ΔadcAΔlmb感染组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和脑中的载菌量均显著降低;ΔadcAΔlmb感染小鼠6 h、9 h和12 h后,血液载菌量显著降低,血液中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平均显著降低;病理切片试验表明,感染7 d后,ΔadcAΔlmb感染组小鼠的心、肝、脾、肺的器官损伤显著降低。5.AdcA和Lmb在猪链球菌2型耐药中的功能研究通过生物被膜测定以及药物敏感试验研究AdcA和Lmb在猪链球菌2型耐药中的功能。生物被膜试验结果表明,与WT相比,ΔadcA、Δlmb和ΔadcAΔlmb的生物被膜形成能力显著下降;ΔadcAΔlmb中与生物被膜形成相关的毒力和黏附基因(gdh、gor、ccpa、fbps、gapd H、gdp P、srt A和per R)表达水平明显下降;ΔadcAΔlmb对杆菌肽、万古霉素、磷霉素和氨苄西林等靶向细胞壁的抗生素敏感性增加。6.猪链球菌2型AdcR在锌稳态中的作用研究为了研究AdcR在猪链球菌2型锌摄入中的作用,本研究构建了adcR基因缺失株ΔadcR与回补菌株CΔadcR,

关键词：猪链球菌2型锌稳态 AdcA Lmb AdcR 毒力耐药性

猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶多克隆抗体制备与亚细胞定位分析

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中国病原生物学杂志 2022年第4期17卷 410-414页

作者：赖芸占冬波蒋小武宜春学院医学院江西宜春336000

目的制备猪链球菌2型(Streptococcus suis,SS2)硫氧还蛋白还原酶(SsTrxR)抗体,分析其在SS2中的定位。方法对猪链球菌2型trxR基因进行生物信息学分析,PCR扩增TrxR基因,酶切、连接,构建重组表达载体pET30a-trxR。IPTG低温诱导表达SsTrxR... 详细信息

目的制备猪链球菌2型(Streptococcus suis,SS2)硫氧还蛋白还原酶(SsTrxR)抗体,分析其在SS2中的定位。方法对猪链球菌2型trxR基因进行生物信息学分析,PCR扩增TrxR基因,酶切、连接,构建重组表达载体pET30a-trxR。IPTG低温诱导表达SsTrxR重组蛋白,镍柱亲和纯化目的蛋白。皮下接种SsTrxR至日本大耳白兔,获取多克隆抗血清。Western blot分析SsTrxR抗血清特异性与在SS2中的定位。结果SsTrxR因子与细菌硫氧还蛋白还原酶的氨基酸序列存在多个保守区域与位点,同属内其它代表性链球菌硫氧还蛋白还原酶氨基酸序列同源性在68.5%以上,拥有Cys-Xaa-Xaa-Cys基序。成功构建pET30a-trxR表达质粒,SsTrxR原核蛋白呈可溶性表达,过镍柱纯化,获得目的蛋白。Western blot检测结果显示SsTrxR与抗血清反应性好,SsTrxR因子分布于细菌胞浆内。结论猪链球菌2型存在硫氧还蛋白还原酶SsTrxR,制备的兔源SsTrxR多克隆抗体特异性好,且该因子为胞内蛋白,为开展TrxR因子在SS2感染与免疫过程中发挥的功能研究奠定了基础。

关键词：猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶多克隆抗体定位分析

猪链球菌2型SUT2基因缺失株的构建及其免疫效果评价

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猪链球菌2型SUT2基因缺失株的构建及其免疫效果评价

作者：杨求磊吉林大学

学位级别：硕士

猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原,可导致人和猪的关节炎、败血症、脑膜炎等疾病,给养殖业带来巨大经济损失的同时严重威胁食品安全和公共卫生安全。SS疫苗接种是预防SS相关疾病的有效预防措施,但SS毒力因子... 详细信息

猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原,可导致人和猪的关节炎、败血症、脑膜炎等疾病,给养殖业带来巨大经济损失的同时严重威胁食品安全和公共卫生安全。SS疫苗接种是预防SS相关疾病的有效预防措施,但SS毒力因子众多,同时存在多种血清型,目前仍然缺乏能够提供交叉免疫保护能力的商品化疫苗。因此,寻找新的毒力因子对SS通用疫苗的研究工作和SS相关疾病的科学防控具有重要的意义。本研究首先采用转座子随机诱变技术和大蜡螟实验筛选和鉴定新的SS毒力相关基因SUT2,随后初步研究其对SS的毒力调控机制生物学特性,最后通过敲除SUT2基因构建弱毒疫苗株并对其进行了免疫效果评价。为了挖掘新毒力因子,本研究首先采用转座子TnYLB-1构建SS基因组转座子突变文库,随后用大蜡螟实验筛选毒力改变的突变株并分离鉴定毒力因子相关基因。结果显示:通过卡那霉素抗性和壮观霉素抗性筛选获得了450株转座子突变株文库,转座效率为83.33%;随后,利用大蜡螟毒性试验对文库进一步筛选,共获得18株SS毒力减弱突变株;最后,经反向PCR和突变株插入位点基因测序分析,共鉴定了8种毒力减弱相关基因,分别为二氨基庚酸脱羧酸、M24金属肽酶、两种假设蛋白、ABC转运通透酶亚基、磷酸吡哆醛依赖性氨基转移酶、ABC转运蛋白结合底物、核糖核酸G和E。随后,我们选择毒力下降最明显的SUT2基因,采用同源重组技术构建了靶向SUT2的基因敲除SS毒株及其回补株,研究该基因的功能。结果显示与野生型相比,ΔSUT2在BHI培养基中并不影响SS生长,但能够影响其链长形态;ΔSUT2显著降低了SS酸碱耐受能力,但显著升高了其生物被膜形成能力;体外实验结果显示ΔSUT2抗PAM(猪肺泡巨噬细胞)吞噬能力、全血存活、溶血活性等方面显著降低,但能通过上调粘附和侵袭相关的基因转录水平增强对人脑微血管内皮细胞(HBMEC/D3)的黏附和侵袭能力;体内实验结果显示ΔSUT2显著提高了小鼠存活率,说明SUT2能够影响SS毒力。综上,SUT2基因对SS2致病性至关重要,并存在多种生物学效应。最后,我们对自然分离的致病性较弱的猪链球菌2型菌株敲除SUT2基因,构建活疫苗JLY022ΔSUT2,探究对链球菌2型、7型的交叉免疫保护。结果显示JLY022ΔSUT2在无佐剂添加情况下单次免疫小鼠,对猪链球菌2型免疫保护率60%,对猪链球菌7型为40%。综上所述,本研究成功构建了SS2转座子文库,鉴定了8种未在SS中报道的毒力相关基因,并证实SUT2参与SS对宿主细胞的黏附侵袭、生物被膜形成、抗吞噬等过程。构建了JLY022ΔSUT2弱毒活疫苗,结果证实其具有一定的猪链球菌血清型2型和7型的交叉免疫保护作用。本研究对猪链球菌2型的致病性和疫苗研究提供了科学依据。

关键词：猪链球菌2型突变文库毒力因子 SUT2 弱毒疫苗

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猪链球菌2型毒力因子研究新进展

中国生物工程杂志 2018年第3期38卷 97-104页

作者：刘静贤何欣韩慧明北华大学基础医学院吉林132013 北华大学基础医学院临床免疫研究中心吉林132013

猪链球菌是一种传染性革兰氏阳性菌,是严重影响养猪业发展的重要人畜共患病原体,造成人类死亡率在5%~20%。其毒力因子在致病过程中发挥着重要作用。近年来对猪链球菌2型的毒力因子研究有诸多新的进展,对其致病机制的了解和对该病有效防... 详细信息

猪链球菌是一种传染性革兰氏阳性菌,是严重影响养猪业发展的重要人畜共患病原体,造成人类死亡率在5%~20%。其毒力因子在致病过程中发挥着重要作用。近年来对猪链球菌2型的毒力因子研究有诸多新的进展,对其致病机制的了解和对该病有效防控都有新的认识。对近些年研究2型猪链球菌毒力相关因子,对蛋白质类、酶类研究的新进展,同时对毒力因子基因表达双组分系统、与宿主免疫系统相互作用的Ⅳ型分泌系统的进展进行总结和分析,以期为猪链球菌病的治疗和疫苗的研制提供新参考。

关键词：猪链球菌2型毒力因子致病机制

猪链球菌2型05ZYH33菌株具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性蛋白的鉴定及功能研究

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中国预防兽医学报 2019年第5期41卷 462-467页

作者：陈平刘冉黄萌萌朱金鲁谢芳倪宏波刘思国张跃灵黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(S.pneumoniae)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;... 详细信息

为了研究猪链球菌2型(SS2)05ZYH33菌株是否具有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)及同工酶,本研究通过同源蛋白比对,发现05ZYH33菌株表面蛋白SSU050630 C端Ss GH20结构域与肺炎链球菌(S.pneumoniae)的NAG Str H的GH20-1结构域具有60%的同源性;经基因克隆、蛋白表达及纯化后的酶活性分析表明Ss GH20具有NAG活性,且其活力为371 U/mg蛋白;其最适反应温度为50℃、最适p H为5.5;其Km值为0.69。通过构建SS2 ssu050630基因缺失株及全菌酶活性测定,显示SS2 05ZYH33菌株具有NAG活性,而ssu050630基因缺失后的菌株则失去了NAG活性,表明SSU050630是SS2 05ZYH33菌株唯一具有NAG活性的蛋白。本研究为进一步探究Ss GH20在SS2致病中的作用及SS2逃避宿主免疫反应的机制奠定了基础。

关键词：猪链球菌2型 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 SSU05_0630 基因缺失同工酶

猪链球菌2型98HAH33基因0267的功能研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第2期40卷 98-102页

作者：骈亚亚聂晶晶高振祥胡继红北京医院国家老年医学中心国家卫生健康委临床检验中心中国医学科学院老年医学研究院100730

目的对猪链球菌2型菌株98HAH33基因0267进行功能研究。方法比较猪链球菌2型野生株98HAH33、突变株Δ0267及回复株CΔ0267在不同生长时期的生长速率,细菌黏附、全血杀伤及巨噬细胞吞噬试验比较对宿主的黏附和抗吞噬能力,仔猪试验比较在... 详细信息

目的对猪链球菌2型菌株98HAH33基因0267进行功能研究。方法比较猪链球菌2型野生株98HAH33、突变株Δ0267及回复株CΔ0267在不同生长时期的生长速率,细菌黏附、全血杀伤及巨噬细胞吞噬试验比较对宿主的黏附和抗吞噬能力,仔猪试验比较在毒力方面的差异。结果野生株、突变株及回复株生长速率一致;野生株对宿主细胞A549、Hep2、HBMEC的黏附率分别是突变株的2.59、4.87和3.08倍,回复株对宿主细胞A549、Hep2、HBMEC的黏附率分别是突变株的2.65、4.65和2.86倍;野生株、突变株和回复株1~3 h在全血中的存活率分别是36.91%、28.12%和41.61%,58.44%、44.06%和58.26%,93.02%、70.08%和95.85%;小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬试验结果显示RAW264.7吞噬野生株、突变株及回复株的菌量分别为2767、5322、2567;仔猪竞争感染试验证明基因0267与猪链球菌2型98HAH33的毒力相关。结论猪链球菌2型98HAH33基因0267与细菌黏附和抗吞噬相关,是一个新毒力因子。

关键词：猪链球菌2型细菌黏附全血杀伤吞噬毒力因子

猪链球菌2型通过诱导IFN-γ促进脑微血管内皮细胞自噬破坏血脑屏障完整性

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中国兽医学报 2020年第12期40卷 2320-2326页

作者：刘嘉楠贾丽姜合祥吴桐李扬雷连成吉林大学动物医学学院吉林长春130062 吉林大学护理学院吉林长春130062 长江大学动物科学学院湖北荆州434023

猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)是一种能够引起猪和人类脑膜炎的人畜共患病原菌,其破坏血脑屏障(BBB)的免疫学致病机制仍知之甚少。本研究通过构建仔猪脑组织切片感染模型和原代猪脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞(PBMEC/AC... 详细信息

猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)是一种能够引起猪和人类脑膜炎的人畜共患病原菌,其破坏血脑屏障(BBB)的免疫学致病机制仍知之甚少。本研究通过构建仔猪脑组织切片感染模型和原代猪脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞(PBMEC/AC)共培养BBB感染模型,探讨SS2感染对BBB通透性的影响。结果显示,脑组织切片和双细胞共培养BBB模型感染SS2后,IFN-γ均显著高表达。在组织切片培养液添加IFN-γ,可见脑组织出现自噬;在双细胞共培养BBB模型中添加IFN-γ后发现跨内皮电阻(TEER)值显著降低,表明BBB通透性降低,IFN-γ破坏了BBB完整性。进一步研究发现,IFN-γ能够促进PBMEC高表达自噬信号分子ULK1、Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,诱导PBMECs的自噬。添加精氨酸可以降低IFN-γ诱导的自噬并恢复BBB细胞模型的致密性。研究表明,IFN-γ可能通过诱导PBMEC自噬破坏BBB的完整性,增强屏障的通透性,从而促进细菌进入脑组织。本研究从免疫学角度为SS2脑膜炎的发生提供了新机制。

关键词：猪链球菌2型脑膜炎 IFN-γ 血脑屏障(BBB) 自噬