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猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

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动物医学进展 2024年第2期45卷 11-16页

作者：周颖赵硕覃国喜梁龙华肖婷陈忠伟卢冰霞秦毅斌林昌华张胜斌段群棚胡庭俊何颖广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 广西壮族自治区兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室/农业农村部中国(广西)-东盟跨境动物疫病防控重点实验室广西南宁530001 广西农垦永新畜牧集团金光公司广西南宁530042 广西农垦永新畜牧集团西江公司广西贵港537100

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感... 详细信息

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

关键词：猪肺炎支原体猪鼻支原体 TaqMan荧光定量PCR

猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定

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畜牧兽医学报 2024年第1期55卷 271-281页

作者：谢青云邢蕙萱于岩飞袁厅熊祺琰熊富强冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 西藏农牧学院动物科学学院林芝850400 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心泰州225300 南京农学大学动物医学院南京210095

猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗... 详细信息

猪肺炎支原体的持续性感染问题频发,同源重组介导的抗原变异扮演重要角色。解螺旋酶RuvA调节霍利迪连接体变构是参与同源重组的关键步骤。鉴于此,本研究旨在原核表达猪肺炎支原体解螺旋酶RuvA重组蛋白,鉴定其DNA结合活性并制备多克隆抗体。试验通过分子克隆构建原核表达质粒pET21a-RuvA,经诱导表达和纯化获得RuvA M hp重组蛋白;免疫家兔制备抗RuvA M hp多克隆抗体,再利用间接ELISA和Western blot试验进行效价测定和特异性验证;利用凝胶迁移试验结合表面等离子共振技术分析RuvA M hp的DNA结合活性;利用凝胶迁移试验结合Western blot试验鉴定RuvA M hp的寡聚特性。结果显示:原核表达的RuvA M hp重组蛋白约为26 ku;制备的抗RuvA M hp多克隆抗体效价为1∶256000,且具有良好的特异性;RuvA M hp具有较强的DNA结合活性,对霍利迪连接体的亲和力高达624.4 pmol·L^(-1)(K D),并且主要以八聚体形式与其形成稳定复合物。通过RuvA M hp的原核表达、多克隆抗体制备及活性鉴定,为后续探索RuvA调解同源重组介导猪肺炎支原体抗原变异的分子机制奠定了基础。

关键词：猪肺炎支原体解旋酶RuvA DNA结合多克隆抗体

猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用

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动物医学进展 2024年第6期45卷 34-38页

作者：刘莹李峰殷宗俊王敬茹李书光郑先瑞山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 滨州市滨城区畜牧兽医服务中心山东滨州256600

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方... 详细信息

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。

关键词：猪肺炎支原体 Taq Man探针实时荧光定量PCR

猪肺炎支原体LAP的结构预测及其抑制剂Bestatin对支原体生长的影响

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中国动物传染病学报 2024年第2期32卷 1-11页

作者：陈蓉郝飞谢星赵琳韦艳娜张磊王丽熊琪琰邵国青冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室南京210014 南京农业大学动物医学院南京210095

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和... 详细信息

本研究旨在以猪肺炎支原体为代表,研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶,有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型,研究其理化特性和高级结构,探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较,分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白,通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白,圆二色谱测定LAP的二级结构,用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高,但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后,分子筛层析显示LAP是六聚体,圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制,且呈现剂量依赖性,但在不同菌株间存在差异,最低在6μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。

关键词：猪肺炎支原体亮氨酸氨肽酶结构活性位点

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基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法的建立

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生物工程学报 2024年第7期 2322-2332页

作者：淦雨洁董青霜张阳何佳蔚王冬经冯志新王佳周可心丁红雷西南大学动物医学院动物支原体学实验室西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所江苏省农业科学院兽医研究所

本研究拟建立一种高特异性的猪肺炎支原体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测方法。首先，构建重组菌大肠杆菌BL21(DE3)-p ET-32a(+)-mhp336，诱导重组蛋白Mhp336表达并纯化，获得的纯化蛋白作为包被... 详细信息

本研究拟建立一种高特异性的猪肺炎支原体酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)抗体检测方法。首先，构建重组菌大肠杆菌BL21(DE3)-p ET-32a(+)-mhp336，诱导重组蛋白Mhp336表达并纯化，获得的纯化蛋白作为包被抗原；然后，确定ELISA方法的抗原包被浓度、封闭液和封闭时间、血清和二抗稀释比例和孵育时间、显色时间和判定标准；之后进行重复性试验、与猪的其他主要病原抗血清的交叉反应性和确定血清最大稀释倍数；最后，用建立的方法检测226份猪血清样品，并与商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法进行比较，确定检测方法的灵敏性和特异性。最终确定Mhp336纯化蛋白的最佳包被浓度为0.05μg/m L，封闭液为含2.5%脱脂奶粉的PBS，封闭时间为1 h，血清稀释比例为1:500，孵育时间为0.5 h，二抗稀释比例为1:10 000，孵育时间为1 h，显色时间为5 min。检测方法的cut off值为0.332。试剂盒的批内和批间变异系数均低于7%。猪血清样品的检测结果表明，本研究建立的检测方法的灵敏性和特异性均优于商品化猪肺炎支原体ELISA抗体检测试剂盒和猪肺炎支原体ELISA恢复期血清抗体检测方法。本研究成功建立了基于Mhp336蛋白的猪肺炎支原体ELISA抗体检测方法，灵敏性和特异性均较好，为猪场猪支原体肺炎的净化提供了检测方法。

关键词：猪肺炎支原体原核表达灵敏性特异性临床样品

2022年中国南方部分地区猪肺炎支原体感染状况的调查与分析

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畜牧兽医学报 2024年第7期 3064-3074页

作者：高一鸣陈国盛倪诗婷佟泽王豪男杨钒杨丽君莫玉鹏谭臣华中农业大学动物医学院生殖健康养殖协同创新中心桂林力源粮油食品集团有限公司

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪地方性肺炎(EP)的原发性病原，可导致猪咳嗽、气喘、消瘦，并因猪的饲料转化率升高、日增重减少、出栏时间延长，从而使养殖成本大大增加，给养猪业造成重大经济损失。本研究旨在对中国... 详细信息

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪地方性肺炎(EP)的原发性病原，可导致猪咳嗽、气喘、消瘦，并因猪的饲料转化率升高、日增重减少、出栏时间延长，从而使养殖成本大大增加，给养猪业造成重大经济损失。本研究旨在对中国南方部分地区猪肺炎支原体的感染状况进行调查与分析。从中国南方部分地区21个规模化种猪场定点采样，首先通过病原检测比较鼻拭子和喉拭子的采样效果，随后以简单随机抽样结合分层抽样确定各猪场样本量。共收集母猪喉拭子样品1 478份，并将调查的猪群按胎次分为“0～1胎母猪”和“≥2胎母猪”,通过实时荧光定量PCR进行病原检测，通过多位点序列分型(MLST)结合保守的p36基因及非保守的p97和p146基因进行分子流行病学分析。检测结果表明，鼻拭子样品的检出率为16.67%,喉拭子样品的检出率为56.67%,且Ct值更低。猪肺炎支原体感染的场检出率为66.67%,但各场感染压力较小，检出率为1.39%～18.57%。其中“0～1胎母猪”检出率为10.05%;“≥2胎母猪”检出率为2.17%。分子流行病学结果显示，7个猪场的流行菌株均为同一序列类型(ST128),不同猪场间的流行菌株高度同源。对于猪肺炎支原体的病原学检测，喉拭子是比鼻拭子更灵敏且有效的活体样品类型，母猪胎次和生猪调运引种是规模化种猪场感染猪肺炎支原体的重要因素。本研究为猪肺炎支原体的防控和净化工作提供理论基础。

关键词：猪肺炎支原体定点采样感染状况分子流行病学

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关于我国种猪场猪肺炎支原体净化的思考

中国兽医杂志 2024年第3期60卷 154-156页

作者：冯志新江苏省农业科学院兽医研究所农业农村部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心江苏泰州225300

猪肺炎支原体是一种对生猪影响较大的细菌性病原体,往往可引起猪群发生慢性感染,且难以从猪群和猪场水平上清除,导致养猪业遭受巨大的经济损失。猪肺炎支原体净化在欧洲和北美已全面启动,且有成功案例,我国才刚刚启动。本文结合国外猪... 详细信息

猪肺炎支原体是一种对生猪影响较大的细菌性病原体,往往可引起猪群发生慢性感染,且难以从猪群和猪场水平上清除,导致养猪业遭受巨大的经济损失。猪肺炎支原体净化在欧洲和北美已全面启动,且有成功案例,我国才刚刚启动。本文结合国外猪肺炎支原体净化方案的经验与我国生猪养殖特殊性的分析,提出分群体、分阶段的“三步法”净化建议,并对我国猪肺炎支原体的净化提出了展望。

关键词：种猪场猪肺炎支原体净化

猪肺炎支原体SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国动物检疫 2024年第2期41卷 72-79页

作者：闫微杨柳龙云志宋文博李倩倩余道兵周明光徐高原黄超汤细彪武汉科前生物股份有限公司湖北武汉430070

为建立一种快速高效的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)检测方法,根据NCBI公布的Mhp保守序列设计4对特异性引物,依据4对引物的荧光定量PCR检测结果及拟合曲线进行相关性分析,筛选出最佳引物(SX4),建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实... 详细信息

为建立一种快速高效的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)检测方法,根据NCBI公布的Mhp保守序列设计4对特异性引物,依据4对引物的荧光定量PCR检测结果及拟合曲线进行相关性分析,筛选出最佳引物(SX4),建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法。该方法可特异性检测Mhp,对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌4型及链球菌2型等病原均无特异性扩增;最佳引物SX4检测的灵敏度可达4.9×10^(1) copies/μL,组内和组间变异系数均小于2%。该方法可稳定检测出工艺生产抗原和市售疫苗中的Mhp菌量。试验表明,本研究成功建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法,其特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于Mhp疫苗抗原生产和临床疫苗中的Mhp菌量检测。

关键词：猪肺炎支原体荧光定量PCR 颜色改变单位(CCU) 相关性

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非洲猪瘟背景下猪肺炎支原体防控措施探讨

今日养猪业 2024年第2期 41-44页

作者：孙睿聪王金丽张莹李君荣金华职业技术学院浙江金华321000 金华市两头乌遗传育种与改良重点实验室浙江金华321000

【目的】探讨猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mph)在猪养殖业中的防控现状以及有效的防控措施,特别是在非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)流行的背景下,提出控制猪群支原体感染,维护猪群健康的重要性和必要性。【方法】通过文... 详细信息

【目的】探讨猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mph)在猪养殖业中的防控现状以及有效的防控措施,特别是在非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)流行的背景下,提出控制猪群支原体感染,维护猪群健康的重要性和必要性。【方法】通过文献综述,实地考查和综合分析,对猪肺炎支原体的防控现状进行了全面梳理。从资源分配不均、生物安全漏洞、治疗策略调整和养殖业经济损失等方面展开讨论,揭示了当前面临的挑战和问题。【结果】在研究过程中发现,猪肺炎支原体的防控受到非洲猪瘟等重大疫病的冲击,资源分配不均、生物安全漏洞、治疗策略调整等问题制约了防控效果。然而,采用完善的检测方案、有效的疫苗保护、合理的药物治疗和科学的饲养管理等措施可以有效降低猪肺炎支原体的传播风险,维护猪群的健康水平。【结论】在当前非洲猪瘟等重大疫病威胁下,维护猪群健康是确保养猪业可持续发展的关键所在。通过采取综合的防控策略,可以有效地降低猪肺炎支原体的传播风险,提高猪群的整体抗病能力,从而确保养猪业在多重威胁中稳健发展。

关键词：猪肺炎支原体非洲猪瘟防控现状防控措施