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猪肠道冠状病毒与入侵受体氨基肽酶N的相互作用

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中国生物化学与分子生物学报 2019年第9期35卷 952-959页

作者：刘炎黄耀伟浙江大学动物科学学院动物医学系

猪肠道冠状病毒是目前危害养猪产业的重要病原。目前已发现能够感染猪肠道的致病性冠状病毒有4种:猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒和猪肠道甲型冠状病毒。冠状病毒感染宿主的第一步是识别宿主细胞膜受体分子并与... 详细信息

猪肠道冠状病毒是目前危害养猪产业的重要病原。目前已发现能够感染猪肠道的致病性冠状病毒有4种:猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒和猪肠道甲型冠状病毒。冠状病毒感染宿主的第一步是识别宿主细胞膜受体分子并与之结合,随后启动入侵及膜融合进而使病毒基因组进入宿主细胞内部。因此,冠状病毒受体是决定其宿主范围及组织嗜性的关键因素。确定冠状病毒受体及病毒与受体的结合机制对预防新发病毒及开发冠状病毒治疗性药物具有重要意义。猪传染性胃肠炎病毒利用猪氨基肽酶N(aminopeptidase N,APN)作为感染宿主的功能性受体,并利用唾液酸作为辅助结合因子。猪APN最初也被鉴定为猪流行性腹泻病毒的功能性受体,但近年的研究结果与前面的报道存在较大的差异,产生了较大的争议。最近的研究认为,猪丁型冠状病毒的功能性受体也是APN,并且猪丁型冠状病毒能够利用多个物种的APN作为功能性受体,这与其跨物种传播具有密切关系。最新发现的猪肠道甲型冠状病毒则不使用APN作为其入侵受体。本文综述了前面3种猪肠道病毒感染宿主细胞的受体及结合机制的研究进展,并比较分析了猪APN及唾液酸在不同猪肠道冠状病毒入侵宿主过程中结合方式的异同,为进一步研究新发猪肠道冠状病毒受体提供参考。

关键词：冠状病毒受体猪肠道冠状病毒氨基肽酶N

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猪肠道冠状病毒四重荧光定量PCR检测方法的建立

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猪肠道冠状病毒四重荧光定量PCR检测方法的建立

作者：黄鑫新疆农业大学

学位级别：硕士

目前,腹泻是对生猪养殖危害较大的疾病之一,发病猪年龄越小其发病率与死亡率也越高。引起猪腹泻的病因种类繁多,如病毒、细菌、寄生虫、饲料变质、中毒和管理因素等,其中,由病毒感染引起的腹泻较为常见且难以防控。近年来,肠道冠状病毒... 详细信息

目前,腹泻是对生猪养殖危害较大的疾病之一,发病猪年龄越小其发病率与死亡率也越高。引起猪腹泻的病因种类繁多,如病毒、细菌、寄生虫、饲料变质、中毒和管理因素等,其中,由病毒感染引起的腹泻较为常见且难以防控。近年来,肠道冠状病毒引起的猪病毒性腹泻广泛流行、且危害较为严重。传统的猪肠道冠状病毒有猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）,而新型的猪肠道冠状病毒也不断涌现。近年来,世界多地的猪场频频发生猪肠道冠状病毒引起的腹泻疫情,2010年后再现的PEDV变异毒株、2012年首次报道的猪δ冠状病毒（PDCoV）以及2017年底在我国广东新发的猪新型α冠状病毒（PEAV）都是这些疫情的主要病原体。这几种冠状病毒导致的腹泻临床症状高度相似,且时常伴随混合感染,仅凭临床症状及病理解剖等手段基本无法鉴别诊断。为开发一种快速、高效、特异、灵敏的检测方法用于检测并鉴别诊断由猪肠道冠状病毒（TGEV、PEDV、PDCoV和PEAV）引起的腹泻,本研究拟建立四重荧光定量RT-PCR检测方法。为了实现该目标,首先分别基于TGEVN,PEDVM,PDCoV M和PEAVN基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,建立单一病原检测方法,结果显示,这四种病毒在单一实时RT-qPCR检测中最低可检至10个基因拷贝数。其次在此基础建立并优化了四重实时RT-qPCR检测方法,最低可检至100个基因拷贝数,单一和四重荧光定量PCR方法的相关系数（R2）均保持在0.99以上,扩增效率均在90%和110%之间。之后,本研究测试了优化后的四重实时RT-qPCR方法的特异性、可重复性等,结果显示,该方法特异性强,仅能出检测本研究所设计的四种猪肠道冠状病毒,与其他猪常见的猪源病毒不存在交叉反应性;该方法的批间和批内重复性高、变异率低。采用本研究建立的四重荧光定量PCR方法分别分析了本实验室于2015年10月到2018年7月期间从我国9省区市21家猪场收集的407份田间腹泻样本,并采用常规RT-PCR方法进行随机验证。结果表明重庆市的PEDV 阳性率最高,为40.2%;山东省的PDCoV 阳性率最高,为100%;宁夏的TGEV 阳性率最高,为63.6%;山东省的PEAV阳性率最高,为80%;混合感染在某些猪场较为普遍,但是TGEV和PEAV的病毒基因拷贝数都较低。上述研究结果表明,本研究建立的四重实时RT-qPCR检测方法为猪冠状病毒引起的腹泻提供了快速、高效、特异和灵敏的检测及鉴别诊断工具,该方法将有助于猪病毒性腹泻的防控及流行病学调查。

关键词：猪肠道冠状病毒多重荧光定量PCR 检测鉴别诊断

干扰素-L3在抗猪肠道冠状病毒中的应用研究进展

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现代畜牧兽医 2023年第6期 88-91页

作者：郭珊珊沂水县姚店子畜牧兽医工作站山东临沂276400

猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV),是造成新生仔猪致死性水样腹泻的主要原因,可引起重大的经济和公共卫生负担。因此,研发新的抗猪肠... 详细信息

猪肠道冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV),是造成新生仔猪致死性水样腹泻的主要原因,可引起重大的经济和公共卫生负担。因此,研发新的抗猪肠道冠状病毒制剂十分必要。虽然几种已发现的猪肠道冠状病毒细胞受体不同,但均主要感染肠道上皮细胞。Ⅲ型干扰素(IFN-L)可选择性作用于上皮细胞,如呼吸道以及胃肠道等,在上皮细胞抗感染中发挥重要作用。文章综述干扰素-L3(IFN-L3)在猪肠道冠状病毒防治中的优势及其在临床应用中的相关理论和治疗策略,旨在为广谱抗猪肠道冠状病毒治疗剂的应用研究提供参考。

关键词：猪肠道冠状病毒 IFN-L IFN-L3

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猪肠道冠状病毒感染机制的研究进展

中国兽医科学 2023年第12期53卷 1579-1584页

作者：张琦周娜娜李佳璇崔文姜艳平唐丽杰东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 黑龙江省动物疾病防控与制剂创制重点实验室黑龙江哈尔滨150030

猪肠道冠状病毒(swine enteric coronavirus,SeCoV)是引起猪病毒性腹泻的重要病原,在世界范围内广泛流行,给全球养猪业带来了危害。本文综述了4种主要的猪肠道冠状病毒感染机制的研究,即传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV... 详细信息

猪肠道冠状病毒(swine enteric coronavirus,SeCoV)是引起猪病毒性腹泻的重要病原,在世界范围内广泛流行,给全球养猪业带来了危害。本文综述了4种主要的猪肠道冠状病毒感染机制的研究,即传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV),包括通过受体APN侵入细胞并诱导宿主细胞凋亡、逃逸宿主的天然免疫,以及与宿主细胞内质网应激系统相互作用的机制,以便为猪肠道冠状病毒研究及相关疾病防控提供参考。

关键词：猪肠道冠状病毒细胞凋亡免疫逃逸内质网应激感染机制

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两种猪肠道冠状病毒PDCoV与TGEV在体外培养细胞的超感染排斥研究

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两种猪肠道冠状病毒PDCoV与TGEV在体外培养细胞的超感染排斥研究

作者：苏权浙江大学

学位级别：硕士

超感染排斥(Superinfection exclusion,SIE)或超感染干扰(Superinfection interference,SII)是指初次感染细胞的病毒可以建立起一种防御机制,防止第二种病毒对细胞进行再次感染。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)是引... 详细信息

超感染排斥(Superinfection exclusion,SIE)或超感染干扰(Superinfection interference,SII)是指初次感染细胞的病毒可以建立起一种防御机制,防止第二种病毒对细胞进行再次感染。猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪丁型冠状病毒(PDCoV)是引起生猪腹泻类疾病的主要病原体,在临床上可以引起感染仔猪急性腹泻、脱水和呕吐等,并且两种病毒对于两周龄以下的感染仔猪均具有高致死率,严重危害我国养猪产业的健康发展。近年来,我国各地猪场流行病学调查表明,PDCoV及TGEV常呈现混合感染,且TGEV的阳性率逐渐降低而PDCoV的阳性率却逐渐升高,同时这两种病毒的感染具有共同的猪肠道上皮细胞嗜性、两种病毒之间不存在抗原交叉反应以及共同利用猪氨基肽酶N(p APN)作为功能性受体等特点,为此我们提出这两种猪肠道冠状病毒可能存在超感染干扰现象。此外,尽管我国拥有众多应对猪肠道冠状病毒的预防措施,但是冠状病毒引起的猪腹泻病仍然在全国范围内流行,这使得我们需要制定新的措施来降低猪肠道冠状病毒对养猪产业的威胁。解析TGEV和PDCoV之间超感染干扰的相关机制对于理解病毒复制机制以及构建新型冠状病毒的防控策略具有重要意义。本研究首先通过荧光定量PCR和间接免疫荧光IFA来分析两种肠道冠状病毒超感染干扰建立的时间点;其次利用药物抑制和入侵实验来分析病毒不同生命周期对超感染干扰建立的影响;最后构建了肠道冠状病毒的肠细胞模型,为进一步研究肠道冠状病毒在靶细胞上的相关机理奠定了基础。具体研究内容如下:1.荧光定量PCR检测方法的构建。针对TGEV和PDCoV的结构蛋白和非结构蛋白设计特异性引物与Taq Man探针。通过基因克隆构建重组标准质粒,优化反应条件使扩增效率E>90%,R>0.99。随后通过敏感性实验、特异性试验以及重复性实验等检验所构建方法的灵敏性及重复性,建立相对应的荧光定量PCR标准曲线。2.超感染干扰现象的研究。利用间接免疫荧光IFA和荧光定量PCR方法检测不同感染方式及不同感染时间点两种病毒的增殖情况。结果表明TGEV与PDCoV之间存在超感染干扰,且在PDCoV或TGEV初次感染4 h后建立稳定的排斥系统。3.超感染干扰作用机制的研究。通过药物抑制和病毒入侵实验研究TGEV复制周期的不同阶段对超感染干扰建立的影响。结果表明,TGEV与细胞结合后不会抑制PDCoV与细胞受体的结合;此外抑制TGEV的复制可以使PDCoV恢复感染。4.肠道细胞模型的构建。对猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)采用有限稀释的方法筛选出一株对PEDV、TGEV、PDCoV、Se ACoV四种冠状病毒均易感的亚克隆细胞系IPEC-39,为进一步研究肠道冠状病毒于靶细胞上作用机理奠定基础。综上所述,TGEV与PDCoV间存在超感染干扰现象,在TGEV或PDCoV病毒感染细胞后4 h建立稳定的排斥系统。此外,通过抑制TGEV的复制,可以使PDCoV恢复感染,表明超感染干扰的建立可能与病毒的复制有关。

关键词：超感染干扰猪肠道冠状病毒肠道细胞模型

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猪腹泻类冠状病毒病的防控

河南畜牧兽医 2023年第15期44卷 26-29页

作者：刘兵兵沁阳市农业农村局河南沁阳454550

猪肠道冠状病毒(PECs)主要引起哺乳仔猪严重腹泻、呕吐和脱水,死亡率高达100%,号称仔猪的“头号杀手”,给我国和世界养猪业造成了巨大的经济损失。为此,总结PECs的致病性、临床特征和防控措施,为改进PECs的诊断、预防和控制提供重要参考.

关键词：猪肠道冠状病毒致病性临床特征疫病防控

猪重要腹泻病毒多重qRT-PCR鉴别检测方法及PEDV、PDCoV分子流行病学研究

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猪重要腹泻病毒多重qRT-PCR鉴别检测方法及PEDV、PDCoV分子流行病...

作者：周洪槿广西大学

学位级别：硕士

猪肠道冠状病毒(PECoVs)和猪轮状病毒(Po RVs)是常见导致猪腹泻的病毒。PECoVs包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪急性腹泻综合征病毒(SADS-CoV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),它们都能引起相似的猪肠道腹泻症状。... 详细信息

猪肠道冠状病毒(PECoVs)和猪轮状病毒(Po RVs)是常见导致猪腹泻的病毒。PECoVs包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪急性腹泻综合征病毒(SADS-CoV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),它们都能引起相似的猪肠道腹泻症状。轮状病毒A群(RVA)、轮状病毒B群(RVB)、轮状病毒C群(RVC)和轮状病毒H群(RVH)是已知在猪中流行的4种Po RVs。PECoVs或Po RVs间常发生混合感染,建立8种猪腹泻病毒的快速检测方法,对病毒的防控有重要意义。PEDV和PDCoV是两种最常见的PECoVs,开展分子流行病学调查,了解它们的遗传变异方向对疫苗的研制和选择具有重要意义。1、猪肠道冠状病毒多重qRT-PCR检测方法的建立及运用猪感染PECoVs后出现类似的临床症状,包括呕吐、腹泻和脱水。本研究根据PEDV N、TGEV M、PDCoV M和SADS-CoV N基因设计引物和探针,建立快速检测这4种PECoVs的qRT-PCR方法。该方法对4种病毒的LOD为121 copies/μL,组内和组间试验变异系数均小于2%,具有高特异性、灵敏度和重复性。使用该方法检测2020-2022年从广西多个猪场采集的3236份猪腹泻样本,PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV的阳性率分别为18.26%、0.46%、13.16%和0.15%,检测结果与先前报道的qRT-PCR方法符合率超过99%。这些结果表明多重qRT-PCR方法为检测PECoVs提供高效准确的技术手段。2、猪轮状病毒多重qRT-PCR检测方法的建立及运用目前在猪中流行包括RVA、RVB、RVC和RVH在内的4种Po RVs,病毒间常发生混合感染。本研究根据RVA、RVB、RVC和RVH的VP6基因设计引物和探针,建立多重qRT-PCR检测方法。该方法对Po RVs的LOD均为15 copies/μL,组内和组间试验的变异系数均小于2%,具有高特异性、灵敏度和重复性。使用该方法检测广西1447份猪腹泻样本,RVA、RVB、RVC和RVH的阳性率分别为42.09%、27.50%、44.23%和13.13%,而且混合感染比单一病毒感染更常见。检测结果与参考方法的符合率在99%以上。结果表明多重qRT-PCR方法为检测猪RVs提供高效准确的技术手段。本研究首次报道猪RVH在我国流行,我们需要更加关注Po RVs的影响。3、2020-2022年广西猪流行性腹泻病毒分子流行病学研究本研究从2020-2022年广西各市的腹泻样本中选择部分PEDV阳性样品进行扩增、克隆和测序,最终得到52株PEDV的S1、M、N基因。序列分析表明,52株PEDV S1、M、N基因的核苷酸及其编码的氨基酸的相似性分别为91.8%-99.9%和89.1%-100%、96.0%-100%和94.2%-100%、95%-100%和94.7%-100%。S1基因编码的氨基酸存在大量变异,而M和N基因编码的氨基酸保守。遗传进化树分析表明52株PEDV大部分属于GⅡ群,而有6株处于S-INDEL群。同时广西毒株间还有潜在同源重组件。本研究表明广西毒株有遗传多样性,应继续加强检测和分子流行病学调查。4、2020-2022年广西猪德尔塔冠状病毒分子流行病学研究本研究从2020-2022年广西猪腹泻样本中选择部分PDCoV阳性样品进行扩增、克隆和测序,最终得到32株PDCoV的S、M、N基因。32株PDCoV与参考毒株的S、M、N基因核苷酸及其编码的氨基酸的相似性均在94.4%以上,表明不同来源的PDCoV S、M、N基因相似性高。S基因编码的氨基酸有多个变异位点,而M和N基因编码的氨基酸较保守。遗传进化树分析表明32株PDCoV均处于中国毒株所在的GroupⅡ。本研究表明广西PDCoV流行毒株的遗传变异特点,为科学防控PDCoV提供依据。

关键词：猪肠道冠状病毒猪轮状病毒 qRT-PCR PEDV PDCoV分子流行病学