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中空纤维固定化猪肝细胞血液灌流治疗暴发性肝功能衰竭

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山东医药 2003年第35期43卷 1-2页

作者：王凤飚李涛杜智杜斌张金卷天津市第四中心医院天津300140 天津市第三中心医院

目的　探讨应用猪肝细胞构建的生物型人工肝支持系统 (BAL SS)治疗暴发性肝功能衰竭 (FHF)的效果 ,为临床应用提供实验依据。方法　采用胶原酶体外灌流法分离幼年猪肝细胞 ,进行肝细胞培养 ,2 4小时后将培养后聚集成球的肝细胞移入中空... 详细信息

目的　探讨应用猪肝细胞构建的生物型人工肝支持系统 (BAL SS)治疗暴发性肝功能衰竭 (FHF)的效果 ,为临床应用提供实验依据。方法　采用胶原酶体外灌流法分离幼年猪肝细胞 ,进行肝细胞培养 ,2 4小时后将培养后聚集成球的肝细胞移入中空纤维舱的纤维外间隙 ,构成 BAL SS;采用两步肝缺血法制备 8只 FHF犬模型 ,将其随机分为两组 ,治疗组 5只 (肝细胞灌流持续 16小时 ) ,对照组 3只 (无肝细胞灌流 ) ;观察两组模型的存活时间 ,肝脏病理学变化和灌流前后两组生化指标变化。结果　与对照组比较治疗组犬存活时间明显延长 (P0 .0 5 ) ;肝脏病理损害程度基本一致。结论　 BAL SS可发挥猪肝细胞的生物合成及解毒代谢作用。

关键词：猪肝细胞暴发性肝功能衰竭中空纤维血液灌流

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用于生物人工肝的猪肝细胞三维立体培养

西安医科大学学报 2002年第2期23卷 136-140页

作者：赵军李晓斌苏清华马建仓西安交通大学第二医院普外科西安710004

目的　研究猪肝细胞在三维立体培养系统 (中空纤维生物反应器 )中的生长、增殖及功能表达情况 ,探讨肝细胞的生物活性与培养时间之间的关系 ,找出在该培养系统中生物人工肝的有效肝功能支持时段。方法　用体重 5～ 8kg健康杂种小猪作为... 详细信息

目的　研究猪肝细胞在三维立体培养系统 (中空纤维生物反应器 )中的生长、增殖及功能表达情况 ,探讨肝细胞的生物活性与培养时间之间的关系 ,找出在该培养系统中生物人工肝的有效肝功能支持时段。方法　用体重 5～ 8kg健康杂种小猪作为肝细胞供体。用胶原酶原位灌注法分离肝细胞 ,将分离计数好的肝细胞悬液 ( 5× 1 0 7～ 1 0× 1 0 7·mL- 1 )注入中空纤维管内间隙进行培养。定期对肝细胞的活性、形态、生长情况及功能表达 (白蛋白合成 )情况进行观察和检测。结果　猪肝细胞在中空纤维管培养系统内生长、增殖及功能表达良好 ,能够在长达 35d的时间内保持活力 ,并呈现一定的生长规律。结论　该系统培养的猪肝细胞在第 5～ 2 5天的范围内能够达到生物人工肝支持治疗的要求。

关键词：三维立体培养猪肝细胞中空纤维生物人工肝细胞培养

RNA干扰DGAT1和DGAT2在猪肝细胞和肌内前体脂肪细胞中表达的研究

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中国畜牧杂志 2018年第7期54卷 91-96页

作者：吴光松燕志宏林鹏飞顾丽菊李平任丽群张芸贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025 贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵州贵阳550025 贵州大学新农村研究院贵州贵阳550025 贵州优农谷生态产业有限公司贵州贵阳550001 贵州省种畜禽种质测定中心贵州贵阳550018 贵州省农业区域经济发展中心贵州贵阳550001

本研究旨在探索DGAT1和DGAT2基因表达对猪脂肪沉积效率的影响。以3日龄宗地花猪为实验动物,针对DGAT1和DGAT2基因m RNA序列设计6对sh RNA序列,构建RNA干扰表达载体,将DGAT1和DGAT2的sh RNA干扰载体分别转染至猪的肝细胞和肌内前体脂肪... 详细信息

本研究旨在探索DGAT1和DGAT2基因表达对猪脂肪沉积效率的影响。以3日龄宗地花猪为实验动物,针对DGAT1和DGAT2基因m RNA序列设计6对sh RNA序列,构建RNA干扰表达载体,将DGAT1和DGAT2的sh RNA干扰载体分别转染至猪的肝细胞和肌内前体脂肪细胞中,采用RT-q PCR筛选出肝细胞和肌内前体脂肪细胞中的最佳sh RNA干扰载体,将最佳干扰载体再次转染肝细胞和肌内前体脂肪细胞,测定细胞代谢液中甘油三酯和总胆固醇含量变化。结果表明:所构建的干扰载体对肝细胞中DGAT1和DGAT2基因的最高抑制效率分别为78.45%和87.52%,对肌内前体脂肪细胞中DGAT1和DGAT2基因的最高抑制效率分别为82.24%和89.82%;肝细胞和肌内前体脂肪细胞培养液中甘油三酯和总胆固醇的含量均降低,其中转染p GPU6/GFP/Neo-DGAT2-1实验组的肝细胞培养液中甘油三酯含量显著低于空白组(P猪肝细胞和肌内前体脂肪细胞代谢液中甘油三酯和总胆固醇的含量。

关键词： RNA干扰 DGAT1基因 DGAT2基因猪肝细胞猪肌内前体脂肪细胞

骨髓间充质干细胞维持猪肝细胞形态与功能的实验研究

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中华肝胆外科杂志 2010年第2期16卷 130-133页

作者：顾劲扬施晓雷张悦丁义涛南京医科大学鼓楼临床医学院肝胆外科 210008 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科 210008

目的建立猪肝细胞与骨髓间充质干细胞（MSCs）体外共培养体系，为生物人工肝的构建提供理想细胞来源。方法自中华实验猪（n=3）髂前上棘抽取骨髓，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁传代培养至第3代；原位两步胶原酶法分离猪肝细... 详细信息

目的建立猪肝细胞与骨髓间充质干细胞（MSCs）体外共培养体系，为生物人工肝的构建提供理想细胞来源。方法自中华实验猪（n=3）髂前上棘抽取骨髓，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁传代培养至第3代；原位两步胶原酶法分离猪肝细胞后与MSCs随机混合培养，观察共培养肝细胞形态和功能的变化水平。结果第3代MSCs纯度〉90％，肝细胞活率〉95％，纯度〉99％。共培养组肝细胞迅速黏附于MSCs表面，在三维空间呈球形聚集生长，异质细胞间出现细胞连接，超微结构与正常肝细胞接近。共培养组肝细胞白蛋白分泌水平和尿素合成能力自第1天培养起均显著高于对照组（P〈O．05），并在第2天达到高峰。结论猪肝细胞与MSCs共培养可维持肝细胞形态与功能，使构建功能性生物人工肝成为可能。

关键词：肝功能衰竭猪肝细胞骨髓间充质干细胞共培养形态功能

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永生化猪肝细胞系的建立及其鉴定

永生化猪肝细胞系的建立及其鉴定

作者：潘小平浙江大学

学位级别：硕士

前言各种原因所致的急慢性肝功能衰竭，因其病情危重，进展迅速，病死率高，是临床亟待解决的治疗性难题。白人工肝支持系统(artificial liver support system，ALSS)被用于治疗各种急性肝功能衰竭，已取得非常好的疗效。但是，由于非... 详细信息

前言各种原因所致的急慢性肝功能衰竭，因其病情危重，进展迅速，病死率高，是临床亟待解决的治疗性难题。白人工肝支持系统(artificial liver support system，ALSS)被用于治疗各种急性肝功能衰竭，已取得非常好的疗效。但是，由于非生物型人工肝缺乏肝细胞的代谢、生物转化等功能。然而生物型人工肝(bioartificial liver，BAL)依赖于生物反应器中的肝细胞发挥着肝细胞的氨代谢和生物转化等重要作用，可以弥补非生物型人工肝的上述缺陷，因此，近年来，以肝细胞为基础的生物型人工肝是目前人工肝治疗肝衰竭的研究热点，不同类型的BAL不断出现，迄今4种BAL系统业已开始进行Ⅱ—Ⅲ期临床验证，譬如HepatAssist、ELAD等。初步结果证明这些BAL治疗是安全、有效的，没有明显的不良事件出现。由于供肝的短缺，生物型人工肝的发展亦面临着困难。然而，由于猪肝细胞的代谢功能与人肝细胞最为接近，目前大多数基础和临床研究均采用原代猪肝细胞作为肝细胞源。但是，由于原代肝细胞在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间及产量有限、难以传代等问题，这样就限制了生物型人工肝的发展。采用永生化技术建立永生化肝细胞，是解决生物型人工肝细胞来源的重要途径之一，可为生物型人工肝治疗肝衰竭提供大量的肝细胞成为可能。本实验采用逆转录病毒载体的方法将SV40大T抗原(SV40 LT)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)导入到原代猪肝细胞，建立永生化猪肝细胞系。将为生物型人工肝系统体外评价、细胞移植、体外药物代谢模型等提供了理想的肝细胞源。材料与方法首先分子克隆技术分别构建含人端粒酶逆转录酶、SV40大T抗原重组逆转录病毒载体;用磷酸钙沉淀法分别将hTERT／pLPCX和SV40 LT／pLXSN转染至对数生长期的PT67细胞，经嘌呤霉素、G418药物压力筛选，建立两株产毒细胞株，并测定两种细胞上清的病毒滴度。其次，用含SV40大T抗原的重组逆转录病毒上清感染原代猪肝细胞，G418药物进行压力筛选获得细胞克隆;接着，用含人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒上清感染细胞克隆，经嘌呤霉素筛选，建立永生化猪肝细胞。最后，采用倒置显微镜、电镜观察细胞形态;Western blot法检测永生化猪肝细胞中端粒酶和SV40大T抗原的表达;RT-PCR检测永生化猪肝细胞HepLP的ALB mRNA的表达;细胞增殖实验绘制细胞生长曲线;生化仪检测细胞上清的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)等指标;ELISA双抗体夹心法检测细胞上清的猪白蛋白;裸鼠致瘤性实验观察其有无肿瘤形成、以及进行细胞染色体核型分析。结果成功的构建了hTERT／pLPCX和SV40 LT／pLXSN重组逆转录病毒载体，获得产生含hTERT、SV40 LT重组逆转录病毒的两种细胞株。用含SV40大T抗原、人端粒酶逆转录酶的重组逆转录病毒感染原代猪肝细胞，并经过筛选后获得三个耐嘌呤霉素和G418药物的永生化猪肝细胞克隆;并传代60代以上。并对其中一个命名为HepLP的永生化猪肝细胞进行鉴定。该细胞均为单层贴壁生长，肝细胞的形态呈椭圆形、典型的上皮细胞样特征。在透射电子显微镜下，所获得的猪肝细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞内丰富的糖原颗粒和大量的线粒体以及内质网结构清晰可见;在扫描电子显微镜下，永生化猪肝细胞的表面可见典型的微状突起物。永生化猪肝细胞呈典型的“S”型生长。永生化猪肝细胞的染色体数目为38(2倍体)。用Western bllot检测该细胞的蛋白，在120KD处出现一条阳性带，表明该细胞系表达端粒酶;在93KD处出现条带，表明该细胞系也表达SV40大T抗原。以原代猪肝细胞为阳性对照，一步法RT-PCR扩增检测结果显示：第6代，第22代，47代的永生化猪肝细胞HepLP和原代猪肝细胞在270 bp处均出现DNA条带，表明该永生化猪肝细胞具有表达ALB mRNA的等肝细胞基本生物学功能。在永生化猪肝细胞的培养上清中均可检测到谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(BUN)的分泌。采用ELISA双抗体夹心法可检测到永生化猪肝细胞培养上清的特异性猪白蛋白的分泌。裸鼠致瘤性试验显示注射永生化猪肝细胞的裸鼠6个月后仍没有观察到肿瘤。结论 1．构建了hTERT／pLPCX和SV40 LT／pLXSN重组逆转录病毒载体。 2．建立了含hTERT基因、SV40 LT基因的重组逆转录病毒的两种产毒细胞株。 3．创建了永生化猪肝细胞的制备方法，并申请发明专利。将为人源性肝细胞、肝非实质细胞等其他细胞的永生化提供了新的方法。 4．建立了的永生化猪肝细胞系，该细胞系具有正常猪肝细胞的生物学特性，已经传代60多代;裸鼠实验显示无致瘤性的。将为生

关键词：肝衰竭生物型人工肝猪肝细胞细胞系人端粒酶逆转录酶永生化 SV40大T抗原猪肝细胞

大规模猪肝细胞低温保存方法的建立及其在生物型人工肝系统中的生存状态

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大规模猪肝细胞低温保存方法的建立及其在生物型人工肝系统中的生...

作者：周霖中国人民解放军军医进修学院

学位级别：硕士

研究背景：既往研究表明，本研究室所建立的猪肝细胞型生物型人工肝脏支持技术(BALSS)，在治疗急性肝功能衰竭模型犬和肝功能衰竭病人中取得了良好的肝功能支持作用;采用足够量的功能良好的猪肝细胞是治疗成功的关键。由于急性肝功能衰... 详细信息

研究背景：既往研究表明，本研究室所建立的猪肝细胞型生物型人工肝脏支持技术(BALSS)，在治疗急性肝功能衰竭模型犬和肝功能衰竭病人中取得了良好的肝功能支持作用;采用足够量的功能良好的猪肝细胞是治疗成功的关键。由于急性肝功能衰竭起病急、发展快，基层医疗单位条件难以制备高质量的猪肝细胞，因此，建立大规模猪肝细胞的低温保存方法，是BALSS临床推广应用的必要技术基础，同时可以减少治疗准备时间。目前用于治疗急性肝功能衰竭患者的冷冻保存的猪肝细胞方法是由Watanabe等建立的，虽然能够一次保存大量的肝细胞，但是该方法操作复杂，费用昂贵，难以推广。本研究目的是建立简便的可适用于临床的即取即用的肝细胞库。本研究比较了多种降温方法对中国实验用小型猪肝细胞低温保存的效果;并分别在离体培养条件下与在BALSS培养条件下，比较了新鲜分离的猪肝细胞与低温保存后复温的猪肝细胞的活率、生化功能和对药物的转化能力及形态学的差异，以建立简便可靠的大规模猪肝细胞的低温保存方法。方法：1、用酶消化法分离小型猪肝细胞，将其随机分成三组：新鲜肝细胞组(对照组)，即将新鲜猪肝细胞直接用于培养观察;其余两组分别采用梯度降温法和程控降温法进行冷冻保存。1个月后复温，先洗脱DMSO等，然后将肝细胞接种于铺有Ⅰ型胶原的培养瓶中，并在NSAL培养液中加入利多卡因、NHCl及果糖，培养6h。定时取培养上清液，测定肝细胞的生化功能和药物代谢功能;并观察肝细胞的显微结构和超微结构，以筛选出最佳的低温保存条件。 2、用酶消化法分离小型猪肝细胞，将其分成新鲜肝细胞组(对照组)和梯丫烃进修学院阶【沦文人规模猪肝细胞低温保存力法的建)及其在生物型人工肝支持系统中的生存状态度降温组。新鲜肝细胞直接在BALSS中培养6h，冷冻猪肝细胞先采用本研究所建立的梯度降温方法，保存于－196OC液氮中，1个月后复温，再在BALSS 中培养6h。将新鲜或冷冻复温后的猪肝细胞置于BALSS生物反应器中，肝细胞循环流经中空纤维管外腔;内腔经医用硅胶管与三角烧瓶相连，形成闭合循环系统;三角烧瓶内含250ml DMEM细胞培养液;在培养液中加入利多卡因、NH．C及果糖。定时检测肝细胞的活率、形态学变化，并取上清测定白蛋白、尿素氮、葡萄糖、利多卡因浓度，以观察冷冻复温后猪肝细胞在生物型人工肝系统中的生存状态。结果：1、新鲜分离的猪肝细胞活率为81％士3．6％;梯度降温组细胞解冻后的活率为 76．3％士 1．9％;程控降温组细胞解冻后的活率为 72．4％土 1．5％。在离体培养同一时间点时，三组间比较其肝细胞的白蛋白与利多卡因含量无显著差别(ryo．05);梯度降温组与新鲜肝细胞组肝细胞的尿素及葡萄糖含量无明显差别(ryo．05)，均明显优于程控降温组(Pmpo．05)。新鲜猪肝细胞的超微结构基本正常，小部分胞膜有小裂孔;冷冻猪肝细胞少部分破裂，存活肝细胞胞膜完整，线粒体轻度浊肿。经培养30min后，新鲜肝细胞膜结构有所恢复;部分冷冻肝细胞之间出现微绒毛结构，细胞器丰富，两冻存组间无明显差别。结果表明：用两种降温方法保存的肝细胞复温后的存活率均较高，与新鲜肝细胞相比其生化功能、利多卡因转化功能及形态学无明显差异，尤其是梯度降温法具有简便易行、功能良好的优点。 2、新鲜猪肝细胞组在BALSS中培养的前4h活率无明显变化(ryo．05);而梯度降温组细胞在培养4h时的活率与oh相比即有显著下降。新鲜肝细胞与冻存肝细胞的总蛋白、白蛋白、尿素及葡萄糖含量均随着培养时间的延长而增加，在培养的同一时间点两组之间无显著差异(P＞0．05)。两组肝细胞利多卡因浓度均随着培养时间的延长而下降，在培养的同一时间段，两组之间利多卡因浓度无显著差异(ryo．05)。新鲜猪肝细胞在生物反应器中培养3h

关键词：猪肝细胞低温保存生物型人工肝大规模

慢性重型肝炎病人血浆对培养的HepG2细胞及胎肝细胞、猪肝细胞体外影响初步观察

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慢性重型肝炎病人血浆对培养的HepG2细胞及胎肝细胞、猪肝细胞体...

作者：程永波第三军医大学

学位级别：硕士

现代生物人工肝以肝细胞为核心生物成分,不仅具有肝特异性的解毒功能,而且具有生物合成、转化代谢等更为复杂的功能,因此越来越多地用于肝衰竭治疗的研究。由于肝衰竭病人体内有大量毒性产物堆集,这些毒性产物在被生物人工肝解除的同时... 详细信息

现代生物人工肝以肝细胞为核心生物成分,不仅具有肝特异性的解毒功能,而且具有生物合成、转化代谢等更为复杂的功能,因此越来越多地用于肝衰竭治疗的研究。由于肝衰竭病人体内有大量毒性产物堆集,这些毒性产物在被生物人工肝解除的同时,反过来也会对反应器中的肝细胞产生不利影响,国外学者已证实肝衰竭病人血浆或血清对体外培养的肝细胞有毒性作用,但相关研究中所采用的血浆或血清基本来自药物性肝衰竭患者,而在我国进行人工肝治疗的大多是乙型肝炎病毒引起的慢性重型肝炎患者,此种类型的血浆对肝细胞的影响尚不清楚。因此有必要对慢性乙型病毒性重型肝炎病人血浆对肝细胞的影响做进一步观察。本课题采用乙型肝炎病毒引起的慢性重型肝炎病人血浆(SHP),初步观察了其对HepG2细胞及胎肝细胞、猪肝细胞的体外影响。实验方法和结果如下: 一、SHP对HepG2细胞活力的影响 MTT法测定SHP培养的HepG2细胞活性结果表明,所有浓度SHP培养的HepG2细胞活性都下降,100%浓度的下降幅度最大,而10%、30%、50%浓度的下降较小。通过测定细胞生长周期,发现SHP培养的HepG2细胞S期所占比例比对照组显著增高,提示细胞生长有可能是受阻于S期。比较SHP灭活前和灭活后对HepG2细胞的影响,发现灭活前和灭活后SHP都显著抑制HepG2细胞活性,但二者间并没有明显差异。二、SHP对HepG2细胞损伤观察 SHP干预HepG2细胞后肝酶检测显示,LDH、γ-GT都显著升高。随着SHP作用时间延长,培养液中上述两种酶活性增高更显著,说明LDH和γ-GT泄漏随时间延长逐渐加重,细胞膜的损伤程度加大,扫描电镜也清楚观察到细胞表面的大疱,大疱是细胞膜损伤的标志之一。检测凋亡率,不管灭活与否、何种浓度,SHP培养的HepG2细胞凋亡率都远高于对照组,随SHP浓度增大凋亡率逐渐增高。三、SHP对HepG2细胞功能的影响在SHP培养HepG2细胞的合成功能实验中观察到,SHP作用后总蛋白合成比对照组显著下降,浓度越高下降程度越大。甲胎蛋白合成SHP组与对照组无明显差异。在解毒功能检测中,发现各种浓度SHP培养的HepG2细胞谷胱甘肽含量均显著高于对照组,提示SHP作用后HepG2细胞解毒功能增强,但这种功能增强持续时间短暂,3d后迅速减弱以至衰竭。四、SHP对胎肝细胞和猪肝细胞的影响采用胎肝细胞和猪肝细胞,检测酶漏出量,结果显示LDH、AST较对照组都显著升高,提示SHP对这两种细胞也可造成细胞膜损伤。检测甲胎蛋白,SHP组都低于对照组,表明SHP对这两种细胞的蛋白合成功能都有抑制作用。形态观察见胎肝细胞和猪肝细胞都出现漂浮死亡、存活细胞胞浆中空泡明显增多等。以上结果提示:1. 慢性重型肝炎病人血浆抑制HepG2细胞生长,这种抑制作用随培养时间的延长而加重,全血浆的抑制作用最严重;2. 慢性重型肝炎病人血浆对HepG2细胞细胞膜有明显损伤,能够诱导HepG2细胞凋亡,此二种变化随血浆浓度的增加和培养时间的延长而加重;3. 慢性重型肝炎病人血浆可抑制HepG2细胞大分子合成,短时间内促进HepG2细胞解毒,但随时间延长解毒功能耗竭;4. 慢性重型肝炎病人血浆对胎肝和猪肝细胞的生长和蛋白合成功能同样有抑制作用,对此两种细胞的细胞膜同样有明显损伤。

关键词： HepG2细胞胎肝细胞猪肝细胞细胞培养重型肝炎慢性血浆体外影响

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猪肝细胞用于生物人工肝的研究进展

中华肝胆外科杂志 2003年第6期9卷 382-384页

作者：王英杰第三军医大学西南医院重庆市400038

异种动物肝细胞一直是国外生物人工肝研究的主要细胞,其中猪肝细胞已成为生物人工肝应用最多的肝细胞.由于猪肝细胞的代谢功能(细胞色素P450含量及其代谢能力)与人工肝细胞最为接近,其混合氧化酶的高水平表达正是代偿肝衰竭解毒功能的... 详细信息

异种动物肝细胞一直是国外生物人工肝研究的主要细胞,其中猪肝细胞已成为生物人工肝应用最多的肝细胞.由于猪肝细胞的代谢功能(细胞色素P450含量及其代谢能力)与人工肝细胞最为接近,其混合氧化酶的高水平表达正是代偿肝衰竭解毒功能的重要基础[1],故猪肝细胞被公认是目前生物人工肝较好的细胞材料.

关键词：生物人工肝猪肝细胞研究进展异种动物肝细胞免疫反应

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猪肝细胞分离方法的改良

四川解剖学杂志 2001年第2期9卷 101-102页

作者：张文秀林丛侯宽永北京大学第三医院外科北京100083

目前,在供体器官短缺的情况下,大家公认猪是最合适的异种器官和组织的提供者,用猪肝细胞治疗急性肝衰病人已有报道.如何将肝细胞最大限度完整地、无损伤地分离出来,这是非常关键和重要的一步.我室在进行猪肝细胞的分离中,逐渐探索出一... 详细信息

目前,在供体器官短缺的情况下,大家公认猪是最合适的异种器官和组织的提供者,用猪肝细胞治疗急性肝衰病人已有报道.如何将肝细胞最大限度完整地、无损伤地分离出来,这是非常关键和重要的一步.我室在进行猪肝细胞的分离中,逐渐探索出一套比较行之有效的方法.　　材料与方法:采用中国实验用小型猪,常规麻醉、消毒、开腹,用D-Hank′s液进行肝脏原位灌注,再用0.02%EDTA-Hank′s液(37℃)灌注18～20mi n,摘取肝脏行多点灌注5min,置肝脏于60目钢网上,用直剪迅速剪开肝脏被膜,用镊子夹起轻轻抖动,并用1640液冲洗,边抖动边冲洗,使细胞滤出漏于烧杯中.与此同时,用剪刀把肝组织剪成小块,再用玻璃注射器芯轻轻研磨,边研磨边冲洗,操作要轻,并保持无菌,收集肝细胞,离心洗涤三次,并逐级用80目、100目、120目、150目钢网过滤.分离出的肝细胞进行计数、台盼蓝拒染试验检查、PAS染色、葡萄糖-6-磷酸酶染色及电镜检查.　　结果:肝细胞存活率90±1.3%,PAS染色显示肝糖元丰富,葡萄糖-6-磷酸酶染色显示酶的活性良好.电镜观察,肝细胞的线粒体、内质网等亚显微结构未见异常.　　对于猪肝细胞的分离,国外文献报道多采用Ⅳ型胶原酶循环灌注法,但费用很昂贵.在实践中,我们用EDTA代替胶原酶,采用肝脏原位灌注+多点灌注+机械研磨的方法,取得了较为满意的效果.此法与胶原酶灌注法比较,从分离的肝细胞数量、活力、肝糖元及细胞中一些酶的活性都与胶原酶法无显著差异,且光镜及电镜观察,显示细胞形态及亚细胞结构未见异常.我们认为此方法易于控制,价格低廉;而胶原酶法容易消化过度,造成细胞膜破损 ,或消化不完全造成多个细胞连在一起,且费用昂贵.实验证明,改良的猪肝细胞分离方法为用猪肝细胞治疗急性肝衰病人的研究提供了一个可行的方法.

关键词：猪肝细胞分离方法胶原酶梭菌肽酶A 蛋白酶急性肝衰