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基于无透镜衍射成像的猪精子三维轨迹提取方法研究

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科学技术创新 2024年第3期 22-25页

作者：李国晓姜玥彤李晨曦武君伟江苏农林职业技术学院信息工程学院江苏镇江连云港立华牧业有限公司江苏连云港

精子活力检测是畜牧养殖领域生产过程中的一个重要环节。现有的计算机辅助精子分析(CASA)方法,利用显微镜拍摄精子运动视频,其评估的依据是由显微镜成像所得到的精子平面运动轨迹。事实上精子个体的运动是在三维空间中进行的。本研究提... 详细信息

精子活力检测是畜牧养殖领域生产过程中的一个重要环节。现有的计算机辅助精子分析(CASA)方法,利用显微镜拍摄精子运动视频,其评估的依据是由显微镜成像所得到的精子平面运动轨迹。事实上精子个体的运动是在三维空间中进行的。本研究提出了一种基于无透镜衍射成像的猪精子三维轨迹提取方法,通过对所拍摄的精液无透镜成像进行重建和图像处理,获得精子头部的平面定位,并针对重建过程中物像距离参数的准确性设计了评价函数,通过自聚焦算法锁定目标颗粒的物像距离,进而获得精子个体的三维运动轨迹。结果表明,该方法对精子个体的平面定位精度达到1.4μm,高度定位精度达到±5μm,能够获得较高精度的三维运动轨迹,有望为精子质量评估和生殖医学研究提供更加科学的数据支持。

关键词：猪精子三维轨迹无透镜成像衍射重建聚焦度评价

基于蛋白组学鉴定猪精子中的性染色体基因表达及其生物学功能

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农业生物技术学报 2022年第9期30卷 1747-1762页

作者：石咏刘怡冰刘华涛王楚端邢凯中国农业大学动物科学技术学院北京农学院动物科技学院

动物的性别控制在畜牧生产中有着重要意义，性控精液在生产中是控制家畜后代性别比例常用的商品，现有性控精液的商用多集中用于奶牛(Bos taurus)，其在奶牛良种扩繁中有重要作用；流式细胞仪分选是主流的性控精液的分选方法，但分选过... 详细信息

动物的性别控制在畜牧生产中有着重要意义，性控精液在生产中是控制家畜后代性别比例常用的商品，现有性控精液的商用多集中用于奶牛(Bos taurus)，其在奶牛良种扩繁中有重要作用；流式细胞仪分选是主流的性控精液的分选方法，但分选过程中对精子的机械损伤和分选后精子活率降低都不可避免，因此利用免疫学方法分选X/Y精子是理想的方法；随着蛋白质组学技术进步，探索猪精子中的蛋白质组成也成为可能。本研究为了明确猪(Sus scrofa)精子中性染色体上蛋白编码基因并分析其生物学功能，寻找猪精子中可能用于性别控制的抗原，收集10只健康种公猪的精液，利用流式细胞仪去除精浆并把精子分离成X/Y精子，通过Label-free蛋白组学技术对分离的猪精子中的蛋白质表达进行定性、定量分析，将其中分布于性染色体上的表达基因提取出来，并进行生物学功能分析，同时将得到的性染色体上表达的蛋白质通过TMHMM 2.0进行跨膜区预测，利用WoLF PSORT进行亚细胞定位预测，利用SignalP 5.0进行信号肽预测，并对筛选得到的部分抗原进行验证。蛋白质组测序共得到蛋白1 925个，肽段13 558个，蛋白质对应的基因有2 976个，其中有67个性染色体基因表达蛋白质，包括65个X染色体基因和2个Y染色体基因。将性染色体上表达的基因进行GO和KEGG分析发现，其主要参与了精子运动相关的能量产生通路。预测到45个蛋白含跨膜结构，47个蛋白位于细胞质膜上或细胞外，28个蛋白能产生信号肽(secretory signal peptides/signal peptides, Sec/SPI)，筛选出脱氧核糖核酸酶1 (deoxyribonuclease like 1, DNASE1L1)、ATP酶H+运输辅助蛋白1 (ATPase H+transporting accessory protein 1, ATP6AP1)、四跨膜蛋白6 (tetraspanin6, TSPAN6)、NADH：泛醌氧化还原酶亚基A1 (NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit A1, NDUFA1)、磷酸核糖焦磷酸合成酶2 (phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2, PRPS2)、NADPH氧化酶重链亚基(NADPH oxidase heavy chain subunit, GP91-PHOX)、B细胞受体相关蛋白31 (B cell receptor associated protein 31, BCA31)、精子顶体相关5 (sperm acrosome associated 5, SPACA5)、TIMP金属肽酶抑制剂1 (TIMP metallopeptidase inhibitor 1, TIMP1)、过氧化蛋白4 (peroxiredoxin 4, PRDX4)和载脂蛋白O样(apolipoprotein O like, APOOL)作为候选抗原，选取ATP6AP1、NDUFA1、PRPS2、GP91-PHOX和TIMP1进行Western blot验证。本研究为探讨猪精子中性染色体上表达的基因和猪精液性别控制的方法提供了参考。

关键词：猪精子蛋白质组学候选基因

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不同穿膜肽载体转染对猪精子受精能力的影响

南方农业学报 2022年第4期53卷 958-968页

作者：陈集成黄秀芸郑自华韦英明杨素芳广西大学/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点试验室广西南宁530004 广西农业职业技术大学广西南宁530007 广西建设职业技术学院广西南宁530007

【目的】明确修饰基因组通过穿膜肽载体转染精子的可行性及穿膜肽载体对精子和受精卵的影响,为实现安全有效地大批量制备猪转基因胚胎提供技术支撑。【方法】以水牛Sohlh2基因为目的基因,通过细胞穿膜肽(C105y、MPG和TAT)和慢病毒介导... 详细信息

【目的】明确修饰基因组通过穿膜肽载体转染精子的可行性及穿膜肽载体对精子和受精卵的影响,为实现安全有效地大批量制备猪转基因胚胎提供技术支撑。【方法】以水牛Sohlh2基因为目的基因,通过细胞穿膜肽(C105y、MPG和TAT)和慢病毒介导转染猪精子后,采用激光共聚焦扫描显微镜观察转染精子形态特征的变化,利用精子图像分析仪(CASA)检测精子活率、平均曲线运动速度(VCL)、平均直线运动速度(VSL)和前向性(STR)等指标,运用精子顶体染色试剂盒测定猪精子顶体反应,并通过体外受精进一步验证不同载体转染制备生产转Sohlh基因猪胚胎的效果。【结果】转染后的猪精子顶体结构完整,细胞膜未见破裂;不同细胞穿膜肽(C105y、MPG和TAT)的猪精子转染阳性率分别为56.74%、50.44%和43.58%,低于慢病毒的转染阳性率(61.48%),但差异不显著(P>0.05,下同)。经穿膜肽C105y转染24 h,猪精子活率(70.09%)、平均直线运动速度(35.36μm/s)、平均曲线运动速度(42.20μm/s)、前向性(1.03μm/s)与对照组相比差异均不显著;而经穿膜肽MPG和TAT及慢病毒转染后,猪精子的各项指标均呈一定程度的下降趋势。细胞穿膜肽转染猪精子的自发顶体反应率与对照组相比无显著差异,慢病毒转染则呈显著的上升趋势(P猪精子的诱发顶体反应率较对照组呈显著下降趋势,而不同细胞穿膜肽转染对猪精子诱发顶体反应率也无显著影响。慢病毒和穿膜肽C105y转染猪精子经体外受精获得的受精卵继续培养24 h后其卵裂率为64.82%和65.91%,与对照组受精卵的卵裂率(64.52%)差异不显著;穿膜肽C105y转染组的囊胚率(15.82%)与对照组间无显著差异,而慢病毒转染组的囊胚率(9.11%)显著低于对照组;在转基因胚胎阳性率方面,穿膜肽C105y转染组显著低于慢病毒转染组(8.54%vs 10.38%)。【结论】穿膜肽C105y对猪精子的受精能力及转基因猪胚胎发育影响小,且毒害作用不明显,是一个能高效转导外源基因的安全载体。

关键词：穿膜肽载体猪精子慢病毒受精能力体外受精转染

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内毒素对17℃环境下猪精子质量的影响

吉林农业大学学报 2022年第1期44卷 92-96页

作者：王硕魏国生李井春郭铭晖刘忠刚李雁冰黄大鹏黑龙江八一农垦大学动物科技学院大庆163319

为探究不同浓度内毒素对17℃保存条件下猪精子质量的影响。在Modena基础稀释液中分别添加浓度为10^(-7),10^(-6),10^(-5),10^(-4)g/mL的内毒素,检测猪精子在此环境下5 d内的精子活率、活力、直线速度、路径速度和凝集指数。结果表明:10^... 详细信息

为探究不同浓度内毒素对17℃保存条件下猪精子质量的影响。在Modena基础稀释液中分别添加浓度为10^(-7),10^(-6),10^(-5),10^(-4)g/mL的内毒素,检测猪精子在此环境下5 d内的精子活率、活力、直线速度、路径速度和凝集指数。结果表明:10^(-7)g/mL组的精子在4~5 d时,直线速度显著降低,而10^(-6)~10^(-4)g/mL各组中的精子,各项质量指标显著降低,但各组精子的凝集指数差异不显著。猪精子对内毒素具有一定抗性,高浓度的内毒素影响精子的保存期;且内毒素不是引起精子大面积凝集的原因。研究为生产实践中猪精液的保存提供了试验依据。

关键词：猪精子内毒素 17℃ 精子质量精子凝集

猪精子玻璃化冷冻方案优化及冻融损伤机制研究

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猪精子玻璃化冷冻方案优化及冻融损伤机制研究

作者：陈昱光西北农林科技大学

学位级别：硕士

猪精液冻存技术是提高生猪养殖业产值、降低养殖风险的关键辅助技术。但由于冻精与鲜精存在平均产仔数量等育种数据上的差距,极大地限制了猪冻存精液在人工授精中的实际生产应用,其关键难题在于猪精子对低温损伤较为敏感,并且冷冻复苏... 详细信息

猪精液冻存技术是提高生猪养殖业产值、降低养殖风险的关键辅助技术。但由于冻精与鲜精存在平均产仔数量等育种数据上的差距,极大地限制了猪冻存精液在人工授精中的实际生产应用,其关键难题在于猪精子对低温损伤较为敏感,并且冷冻复苏致猪精子损伤的机制尚不完善,难以针对性地优化。与此同时,近年来精液的玻璃化冷冻正成为精液冷冻技术的另一热点研究方向。目前人精子玻璃化冷冻程序已经逐渐完善,冷冻技术正趋于成熟,犬、马、驴、羊等动物的精子玻璃化冷冻也取得了较好的成果。然而迄今为止猪精子的玻璃化冷冻并没有良好的技术方案,仅有零星的研究表明玻璃化冷冻后猪精子的染色质完整性与鲜精差异不显著,可以更好地对猪精子遗传信息进行保存,但精子本身的活力几乎完全丧失。因此,本研究利用代谢组和蛋白组学分析以及分子实验验证,探索冻复苏致猪精子损伤的机制,同时对猪精子的玻璃化冷冻方案进行优化,评估玻璃化冷冻对猪精子的影响,并与慢速冷冻的影响相比较,研究获得的主要试验结果如下:1.慢速冷冻损伤线粒体,导致活性氧泄露加剧,同时自由能驱动的活性氧消除被抑制利用Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)共染、DCFH-DA染色以及JC-1染色检测慢速冷冻前后的精子质量变化,发现冻融后精子质膜受损,活性氧(reactive oxygen species,ROS)升高的同时线粒体膜电位水平发生了下降。添加铁离子螯合剂甲磺酸去铁胺(deferoxamine,DFO)后精子PI阳性率和ROS水平均发生显著下降(P精子活率没有发生显著变化,因此消除芬顿反应无法阻止精子死亡;添加谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)类似物Ebsen后精子ROS水平显著下降(P精子活率没有发生显著变化,说明消除ROS诱导的脂质过氧化过程并不能增加精子的冻融后存活能力,冻融可能导致了较为复杂的代谢紊乱。因此选取了冻融后高活力以及低活力组的精子作为研究对象进行代谢组测序,对筛选出的差异代谢物进行富集分析,以探明对冻融有较高耐受力的精子的代谢特征。结果表明,冻融过程中,猪精子活力改变在代谢模式上体现为线粒体内自由能驱动的ROS消除被抑制。并且对冻融前后猪精子ATP水平进行检测也发现冻融后精子的ATP水平显著下降(P精子死亡的关键。2.探索和优化金属表面玻璃化冷冻精子的方法玻璃化冷冻具有冻融迅速的特点,冰晶产生较少不易损伤细胞膜结构,因此本研究采用和优化了猪精子玻璃化冷冻方法,基于球体法、薄膜法和金属表面法三种技术流程,设计了共计95种玻璃化冷冻方案,结果表明仅有基于金属表面法玻璃化冷冻(metal surface vitrification,MSV)猪精子的方案中出现存活精子。而后以成功的方案为基础,对玻璃化冷冻稀释液、冷冻前孵育时间、复苏程序和冷冻保存时间进行优化,最终的玻璃化冷冻方案可以使复苏后的精子活率最高达到9.00±0.61%,相较于目前已发表的研究文章所公布的方案,本文所优化的猪精子玻璃化冷冻方案有了一定程度的改善。3.玻璃化冷冻可以在一定程度上避免冻融导致的猪精子代谢紊乱为了评估玻璃化冷冻对猪精子的影响,对MSV冻融的精子进行DCFH-DA染色以及JC-1染色,结果表明,经历MSV冻融后的猪精子,ROS水平显著低于慢速冷冻组(P猪精子相比,经历MSV冻融后的猪精子ROS水平和线粒体膜电位水平不发生显著变化。针对玻璃化冷冻组与慢速冻融的猪精子高活力组以及低活力组的代谢组学分析发现,玻璃化冷冻组的代谢产物与慢速冻融的猪精子高活力组更相似。选择玻璃化冷冻组和慢速冻融的猪精子高活力组的差异代谢物进行分析时发现,富集到的代谢产物在精子中的功能与自由能驱动的ROS消除有关,具体到蛋白质学差异代谢物的分析更加明确了这一点。而后分别检测鲜精组、玻璃化冷冻组、慢速冻融的猪精子高活力组与低活力组的NADP和NADPH各自的量以及比值,发现NADP、NADP和NADPH的比值同样发生显著上升(P<0.05),但不同点在于,玻璃化冷冻组的NADPH含量相较于鲜精组差异不显著,说明活性氧消除所需的自由能驱动力得到维持,NADP正常向NAD

关键词：猪精子冷冻损伤玻璃化冷冻慢速冷冻 ROS

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猪精子获能过程中泛素介导顶体酶抑制剂降解

猪精子获能过程中泛素介导顶体酶抑制剂降解

作者：尹伊延边大学

学位级别：硕士

获能是精子发育过程中的一个关键环节,也是精子获得受精能力的一个重要机制。获能涉及一系列的结构和功能改变,包括膜修饰,酶活性调节,以及蛋白磷酸化,在这段时间内,精子获得识别和结合透明带(ZP)的能力,并且在与卵母细胞的质膜融合前... 详细信息

获能是精子发育过程中的一个关键环节,也是精子获得受精能力的一个重要机制。获能涉及一系列的结构和功能改变,包括膜修饰,酶活性调节,以及蛋白磷酸化,在这段时间内,精子获得识别和结合透明带(ZP)的能力,并且在与卵母细胞的质膜融合前进行穿透。目前,已有研究显示,泛素-蛋白酶体系统在精子-ZP相互作用、精子膜改变、顶体胞吐等方面的调控作用。泛素-蛋白酶体系统是一种依赖ATP的酶机制,是通过由小分子伴侣蛋白泛素共价连接组成的等肽链,以26S蛋白酶体降解的底物蛋白质为目标,对靶蛋白进行稳定、可逆的翻译后修饰。顶体酶主要以一种叫做顶体酶原的非活性酶原形式出现,在精卵结合过程中,与ZP糖蛋白的硫酸基高度亲和力结合,将顶体酶原转化为顶体酶,帮助精子穿透ZP。顶体酶抑制剂(AI)的作用是通过抑制顶体酶的活性来防止精子被早期释放的顶体酶所损伤,是精子与卵母细胞相互作用的重要环节。本试验的主要目的是探究猪精子体外获能前后顶体酶抑制剂表达量的变化,以及AI的泛素化水平,更加深入地了解泛素-蛋白酶体途径在猪精子获能过程中的作用机理。本试验选用18-24月龄的长白公猪精液,对体外获能前后精子的获能状态、AI和泛素(Ub)蛋白的表达变化、AI和Ub的免疫荧光定位、AI和Ub的免疫共沉淀进行了分析。试验结果显示:1、与鲜精组相比,获能精子组精子动力学参数VSL和BCF显著升高(P精子的活力和活率显著下降(P精子酪氨酸磷酸化水平极显著升高(P精子AI表达量显著降低(P精子头部顶体区域;4、免疫共沉淀结果显示,在30kDa处出现蛋白条带,且随着E1抑制剂浓度的增加,条带逐渐变浅。结论如下:1、获能降低了精子的质量参数,包括活力、质膜完整性,顶体膜完整性以及精子的活率,对精子的质量造成了一定影响,使精子的逐渐走向凋亡。2、在猪精子体外获能期间,精子蛋白酪氨酸磷酸化水平明显提高,泛素化水平增强,且顶体酶抑制剂被降解。3、获能前,顶体酶抑制剂抑制了顶体酶的活性,从而防止精子受到早期释放的顶体酶的影响。4、在猪精子获能期间,泛素-蛋白酶体途径识别并降解了顶体酶抑制剂,使顶体酶原能够转化为顶体酶,释放出有活性的顶体酶,为后续穿透透明带,完成受精做准备。

关键词：猪精子获能顶体酶抑制剂泛素-蛋白酶体系统

维甲酸对体外热处理猪精子活力、抗氧化性能及其糖脂代谢的影响

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畜牧与兽医 2023年第11期55卷 1-10页

作者：石一凡李晓彤刘俊泽李春梅李延森南京农业大学动物科技学院家畜环境控制与智慧生产研究中心江苏南京210095

旨在探究维甲酸(RA)对体外热处理猪精子活力、抗氧化性能及其糖脂代谢的影响。将相同来源的精液离心重悬于EBSS培养基,随机分为5组,在39℃环境条件下分别孵育0、1、2、3和4 h后,测定精子活力,筛选合适的孵育时间。将相同来源精液离心重... 详细信息

旨在探究维甲酸(RA)对体外热处理猪精子活力、抗氧化性能及其糖脂代谢的影响。将相同来源的精液离心重悬于EBSS培养基,随机分为5组,在39℃环境条件下分别孵育0、1、2、3和4 h后,测定精子活力,筛选合适的孵育时间。将相同来源精液离心重悬后,随机分为6组:对照(CON)组、10、50、100、1000 nmol·L^(-1)RA组和DMSO组,在39℃环境条件下孵育3 h,测定精子活力,筛选RA适宜添加剂量。将相同来源精液离心重悬后,随机分为4组:37℃、37℃+RA、39℃、39℃+RA。37℃+RA组和39℃+RA组培养基中RA浓度为100 nmol·L^(-1),37℃组和39℃组培养基中不含RA,37℃组和37℃+RA组于37℃环境下孵育,39℃组和39℃+RA组于39℃下孵育,测定精子活力,并利用蛋白荧光免疫方法,检测维甲酸受体α(RARα)蛋白定位表达,收集精子用于精子抗氧化和糖脂代谢指标的测定。结果显示:1)39℃处理条件下,随着孵育时间的增加,精子的运动性能逐渐变差。2)39℃处理3 h条件下,RA能改善精子运动性能,且浓度为100 nmol·L^(-1)时效果最好。3)与37℃组相比,39℃培养会显著降低精子总活力及前进运动精子比例(P精子比例(P精子总活力、前进运动精子比例以及快速运动精子比例(P精子比例(P精子丙二醛(MDA)水平(P精子MDA水平(P精子T-SOD活力(P精子丙酮酸、葡萄糖、总胆固醇及甘油三酯含量无显著影响。4)RARα蛋白表达主要集中在精子尾部的主段和末段,头部和富含线粒体的中段有较弱表达,但不明显。100 nmol·L^(-1)RA未明显改变RARα蛋白表达位置。结论:猪精子能够表达RARα蛋白,热处理使精子运动性能显著降低,RA能改善热处理猪精子的运动性能,这可能与RA能降低精子MDA含量,增加T-SOD活性,提高精子抗氧化能力有关。

关键词：维甲酸猪精子热处理抗氧化糖脂代谢维甲酸受体α

解冻稀释液中添加精浆对冻融猪精子品质的影响

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中国畜牧兽医 2022年第2期49卷 615-623页

作者：王轶男孔令敏徐海峰张正文李春宇尹伊金一吕艳秋延边大学农学院延吉133002 长春市第一中等职业学校长春130000 长春市经开区兴隆山镇政府长春130000

【目的】探究冷冻前添加热休克蛋白A8(heat shock protein A8,HSPA8)和解冻后添加不同浓度精浆(seminal plasma,SP)对冻融猪精子的影响。【方法】采用手握法采集长白猪精液,添加0.5μg/mL HSPA8到猪精液冷冻保护剂中进行细管分装,投入... 详细信息

【目的】探究冷冻前添加热休克蛋白A8(heat shock protein A8,HSPA8)和解冻后添加不同浓度精浆(seminal plasma,SP)对冻融猪精子的影响。【方法】采用手握法采集长白猪精液,添加0.5μg/mL HSPA8到猪精液冷冻保护剂中进行细管分装,投入液氮中保存3周后进行解冻,解冻后添加不同浓度精浆(0、10%、30%和50%),对冻融后长白猪精子的运动能力、质膜完整性、顶体完整性、细胞凋亡、线粒体膜电位、鱼精蛋白缺乏及体外获能水平等进行评估。【结果】与对照组相比(无HSPA8和精浆),添加0.5μg/mL HSPA8处理组(无精浆)的精子直线速度(VSL)、曲线速度(VCL)、平均路径速度(VAP)和前向性运动(STR)均显著提升(P精子直线性运动(LIN)和运动的摆动性(WOB)均无显著差异(P>0.05);精子质量参数中活力、质膜完整性和顶体完整性均显著升高(P精子鱼精蛋白缺失率显著降低(P精子蛋白酪氨酸磷酸化水平显著提高(P精子VSL、VCL、VAP、LIN、STR和WOB均显著提升(P精子活力、质膜完整性、顶体完整性和线粒体膜电位均显著提高(P精子鱼精蛋白缺失率显著降低(P精子蛋白酪氨酸磷酸化水平显著提高(P精子质量,将会对猪精液的冷冻保存及商业化生产提供一定的参考。

关键词：猪精子热休克蛋白A8(HSPA8) 精浆(SP) 冻融质量参数

稀释液添加精氨酸对猪精子活力、一氧化氮合酶和一氧化氮含量的影响

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畜牧与兽医 2022年第12期54卷 1-8页

作者：李晓彤石一凡锁云鹏崔洋洋王猛李春梅李延森南京农业大学动物科技学院江苏南京210095

试验旨在探讨39℃体外培养时,常温稀释液中添加不同浓度L-精氨酸(L-Arg)对猪精子活力、NO含量及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的影响。首先根据已有专利和文献报道设计了3种稀释液配方:高糖+青霉素钠+硫酸链霉素(M+N组),高糖... 详细信息

试验旨在探讨39℃体外培养时,常温稀释液中添加不同浓度L-精氨酸(L-Arg)对猪精子活力、NO含量及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的影响。首先根据已有专利和文献报道设计了3种稀释液配方:高糖+青霉素钠+硫酸链霉素(M+N组),高糖+庆大霉素硫酸盐(M+Q组),低糖+青霉素钠+链霉素(L+N组),并将商用稀释液设为对照组。使用稀释液重悬后,17℃恒温箱中孵育精子,每隔24 h测定一次活力指标。其次,取成年健康大约克公猪精液(精子活力>70%)离心重悬于自配精液稀释液,分别添加不同浓度L-Arg(0.0、0.5、1.0、2.0 mmol/L)置于39℃下孵育0、2、4 h,分别收集稀释液和精子,利用计算机辅助精子分析方法(computer-assisted sperm analysis,CASA)测定精子活力参数,评估精液稀释液中L-Arg的最适添加浓度。用最适浓度L-Arg处理猪精子,39℃孵育0、2、4 h,收集稀释液和精子,使用CASA分析测定精子活力参数,测定NO含量,利用蛋白免疫荧光定位方法测定精子中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endotheliale nitric oxide synthase,eNOS)蛋白表达位置,并检测其酶活力,利用qPCR方法测定精子中iNOS mRNA表达水平,明确NOS在精子稀释和复温过程中不同时间点的变化特点。试验结果显示:1)与对照组相比,M+Q组可有效提高精子活力、向前运动比例、快速运动比例及原地摆动比例,降低精子不运动比例,保存效果相对较好。2)39℃体外培养精子2、4 h时,与对照组相比,精液稀释液中添加1 mmol/L和2 mmol/L L-Arg可显著提高精子细胞活力、向前运动比例、快速运动比例及慢速运动比例,显著降低精子原地摆动和不运动比例(P精子2、4 h时,和对照组相比,1.0 mmol/L L-Arg组NO含量呈升高趋势,总一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase,TNOS)活力增强,iNOS酶活力显著增强(P精子0、4 h时,L-Arg组精子细胞iNOS基因的相对表达显著高于对照组(P猪精子iNOS基因降解,增强NOS酶活力,促进NO的生成,维持精子活力。

关键词：猪精子精氨酸一氧化氮一氧化氮合酶精液配方