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猪等孢球虫顶膜抗原AMA1蛋白的生物信息学分析及原核表达

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华南农业大学学报 2024年

作者：叶欣欧璇黄仪娟陆肖翁亚彪林瑞庆华南农业大学兽医学院佛山市正典生物技术有限公司

【目的】预测分析猪等孢球虫AMA1蛋白的生物学特性、结构及功能，并构建AMA1基因的原核表达载体，表达、纯化AMA1蛋白。【方法】本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列，使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行... 详细信息

【目的】预测分析猪等孢球虫AMA1蛋白的生物学特性、结构及功能，并构建AMA1基因的原核表达载体，表达、纯化AMA1蛋白。【方法】本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列，使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行分析。构建原核表达载体pET23a-AMA1，将其转入至大肠埃希菌表达菌株BL21 (DE3)中，对诱导时间、温度及IPTG浓度进行优化，确定最佳诱导表达条件。采用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化，获得AMA1重组蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。【结果】生物信息学预测显示，AMA1蛋白由317个氨基酸组成，蛋白分子式为C1512H2310N394O490S14，是不稳定的亲水性蛋白；其二级结构α螺旋占17.74%，β折叠占30.65%，转角占30.65%，无规则卷曲占20.96%；属于无信号肽的跨膜蛋白，具有多个B细胞抗原表位。同时，成功构建pET23a-AMA1重组表达质粒，经诱导表达条件优化后，确定最佳诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG浓度下28 ℃诱导12 h，主要以可溶性蛋白形式存在，蛋白大小约为25 800，纯化出蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。【结论】本研究结果阐明了猪等孢球虫AMA1蛋白的结构特征以及通过原核诱导表达获得了重组蛋白，为建立猪等孢球虫病的免疫学诊断方法奠定了基础，为后续疫苗的研发提供了新的候选基因。

关键词：猪等孢球虫顶膜抗原 AMA1 原核表达生物信息学

猪等孢球虫感染仔猪血液生理生化指标动态变化

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河南农业大学学报 2008年第3期42卷 306-312页

作者：宁长申王芳张龙现崔会玲朱静静姚雷菅复春李祥瑞南京农业大学动物医学院江苏南京210095 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 郑州大学第二附属医院检验科河南郑州450014

应用纯种猪等孢球虫（Isospora suis）孢子化卵囊人工感染9头6日龄仔猪，检测了感染前1d和感染后1，3，6，9，11d时血液生理生化指标、结果表明，仔猪感染I．suis后，白细胞数在感染后1d开始增多，11d达最高；红细胞在感染后3d开始减少... 详细信息

应用纯种猪等孢球虫（Isospora suis）孢子化卵囊人工感染9头6日龄仔猪，检测了感染前1d和感染后1，3，6，9，11d时血液生理生化指标、结果表明，仔猪感染I．suis后，白细胞数在感染后1d开始增多，11d达最高；红细胞在感染后3d开始减少，9d最低，11d时恢复到感染前水平．血清丙氨酸氨基转移酶活性逐渐升高，感染后11d时达最高值；天冬氨酸转氨酶感染后6d升高并达到最高；感染后1d碱性磷酸酶活性下降，11d最低；血清乳酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶、α-羟丁酸脱氢酶活性均呈下降趋势，但无显著差异、感染后1d时白蛋白含量下降，至11d恢复到正常水平；球蛋白含量持续下降，但差异不显著．血清葡萄糖含量升高但无显著变化．感染后1～3d时血清尿素氮含量降低，之后逐渐升高，至11d时达最高；尿酸在感染后1～3d升高，之后持续下降，至11d时最低、血清总胆固醇持续降低；甘油三酯在感染后1～9d升高，11d时恢复到感染前水平．血清K^＋含量在感染后持续降低，但差异不显著．嗜中性白细胞，单核细胞，血红蛋白含量，红细胞压积，总蛋白含量，Na^＋，Cl^-，Ga^2＋，Mg^2＋含量均无明显变化．

关键词：猪等孢球虫生理生化指标仔猪

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猪等孢球虫纯种卵囊扩增及生物学特性研究

河南农业大学学报 2005年第4期39卷 410-416页

作者：刘光辉宁长申张龙现陈丽颖程俊贞贺桂芬闫文朝杨宇程利锋河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 许昌市畜牧兽医站河南许昌461000

应用单卵囊分离技术,获得猪等孢球虫纯种卵囊,给6头3日龄长大二元仔猪每头经口一次人工感染30个纯种猪等孢球虫孢子化卵囊,收集纯种后代,再对6头3日龄长大二元仔猪每头人工感染2 000个孢子化卵囊继代扩增.观察人工感染仔猪的排卵囊规律... 详细信息

应用单卵囊分离技术,获得猪等孢球虫纯种卵囊,给6头3日龄长大二元仔猪每头经口一次人工感染30个纯种猪等孢球虫孢子化卵囊,收集纯种后代,再对6头3日龄长大二元仔猪每头人工感染2 000个孢子化卵囊继代扩增.观察人工感染仔猪的排卵囊规律包括潜隐期、显露期、排卵囊高峰期及每克粪便中卵囊数(OPG值)和仔猪感染后的临床症状,进行了扩增卵囊的孢子化过程及形态结构观察和显微照像.结果表明,感染30个猪等孢球虫孢子化卵囊的仔猪最早在感染后第8d(8 days post-inoculation,DPI 8)从粪中检出卵囊,排卵囊高峰期在DPI 17～21,持续4～5 d,显露期15～18 d;感染2 000个猪等孢球虫孢子化卵囊的仔猪最早在DPI 5从粪中检出卵囊,排卵囊高峰期在DPI 8～13,持续4～6 d,显露期7～13 d.潜隐期、显露期、OPG值与感染剂量存在相关关系,即感染剂量越小,潜隐期越长,显露期越长,OPG值越小;反之亦然.感染30个卵囊的仔猪无临床可见病征;感染2000个卵囊的仔猪呈现腹泻甚至黄色水样腹泻等明显症状.常规培养新收集的猪等孢球虫卵囊,2 h时胚孢子开始分裂,8 h分裂成2团,12 h形成2个孢子囊,20h开始形成子孢子并可见内残体,最早26 h卵囊完全孢子化;72 h时孢子化率达50%,96 h达80%.本试验扩增和继代扩增所获球虫卵囊,与亲本和文献报道的猪等孢球虫生物学特性相一致.

关键词：仔猪猪等孢球虫感染扩增生物学特性

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猪等孢球虫的致病性及生活史的研究

华南农业大学学报 1998年第4期19卷 10-13页

作者：李小玲林辉环翁亚彪华南农业大学动物医学系

猪等孢球虫能致仔猪球虫病，接种２０万孢子化卵囊后３ｄ出现腹泻，第４ｄ水泻，仔猪脱水消瘦，死亡率１５％，接种后５ｄ排卵囊，持续５ｄ显微病变见肠绒毛萎缩，局部粘膜糜烂与溃疡，并出现纤维素性坏死性肠炎猪等孢球虫的发育史... 详细信息

猪等孢球虫能致仔猪球虫病，接种２０万孢子化卵囊后３ｄ出现腹泻，第４ｄ水泻，仔猪脱水消瘦，死亡率１５％，接种后５ｄ排卵囊，持续５ｄ显微病变见肠绒毛萎缩，局部粘膜糜烂与溃疡，并出现纤维素性坏死性肠炎猪等孢球虫的发育史包括２代无性生殖和１代有性生殖，多寄生于空肠、回肠；感染后３６ｈ出现第１代裂殖体，８４ｈ出现第２代裂殖体有性阶段出现在感染后９６ｈ，１０８ｈ出现未成熟卵囊。

关键词：猪等孢球虫致病性生活史

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猪等孢球虫PCR诊断方法的建立

中国农学通报 2007年第9期23卷 63-69页

作者：刘光辉宁长申张龙现程俊贞菅复春河南省动物疫病预防控制中心河南郑州450008 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002 许昌市畜牧兽医工作站河南许昌461000

参照GenBank收录的Isospora suis 18SrRNA基因全序列(U97523),利用引物分析软件Oligo 6.57和Primer Premier 5.0设计了一对引物(上游引物:5'-tcctgcgagtactcatatgc-3';下游引物:5'-gttcagc-tacgcataccttg-3'),首次扩增出猪等孢球虫分离株的18SrRNA基因序列,结合GenBank上登录的相关原虫序列,用DNAstar4.0软件比较其同源性,经Clustalx1.81序列比对,Paup4.0、Treeview3.0、Phylip种系发育关系软件分析后,证实该分离株为猪等孢球虫,并且河南不同地区之间的猪等孢球虫没有明显遗传差异。

关键词：猪等孢球虫 PCR 18SrRNA基因种系发育关系

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猪等孢球虫研究进展

动物医学进展 2019年第6期40卷 88-91页

作者：戚南山康桦华林栩慧吴彩艳吕敏娜李娟胡俊菁肖文婉廖申权孙铭飞广东省农业科学院动物卫生研究所农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站广东省畜禽疫病防治研究重点实验室

猪等孢球虫是一种能引起仔猪球虫病的专性寄生性原虫,可引起仔猪严重腹泻甚至死亡,其发病率可高达50%~75%,病死率高达75%,呈世界性流行,严重危害养猪业发展。目前对仔猪球虫病的防控主要以药物预防为主,随着耐药虫株的不断产生及公众对... 详细信息

猪等孢球虫是一种能引起仔猪球虫病的专性寄生性原虫,可引起仔猪严重腹泻甚至死亡,其发病率可高达50%~75%,病死率高达75%,呈世界性流行,严重危害养猪业发展。目前对仔猪球虫病的防控主要以药物预防为主,随着耐药虫株的不断产生及公众对药物残留的高度关注,使得这一防控手段面临巨大挑战,新型抗猪球虫药物、疫苗及其他防控手段亟待研究开发。论文对猪等孢球虫的生活史、基因组学、免疫学及其与其他微生物的互作关系等方面进行综述,以期为仔猪球虫病的综合防控提供参考。

关键词：猪等孢球虫生活史免疫学基因组学相互作用

猪等孢球虫部分生物学特性研究及巢式PCR方法建立

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猪等孢球虫部分生物学特性研究及巢式PCR方法建立

作者：姚雷河南农业大学

学位级别：硕士

先后共九次应用纯种猪等孢球虫孢子化卵囊人工感染无球虫仔猪,对仔猪感染猪等孢球虫后的排卵囊规律进行了研究。结果表明:潜隐期集中出现在感染后第5d,显露期为4—7d。感染1万、5万、100万猪等孢球虫卵囊组在第一次排卵囊结束后1—2d出... 详细信息

先后共九次应用纯种猪等孢球虫孢子化卵囊人工感染无球虫仔猪,对仔猪感染猪等孢球虫后的排卵囊规律进行了研究。结果表明:潜隐期集中出现在感染后第5d,显露期为4—7d。感染1万、5万、100万猪等孢球虫卵囊组在第一次排卵囊结束后1—2d出现第二次排卵囊高峰。卵囊孢子化后出现厚壁型与薄壁型卵囊。排卵囊后期薄壁型卵囊逐渐增多。应用纯种猪等孢球虫孢子化卵囊人工感染9头6日龄仔猪,应用流式细胞仪分别检测了感染前和感染后1、3、6、9、11d(DPI)外周血中CD3、CD4、CD8T细胞水平,以探讨仔猪感染猪等孢球虫后T细胞亚群的变化规律。结果显示,DPI 3 CD3、CD4T细胞增加,之后下降,但差异均不显著(p猪感染猪等孢球虫后,其免疫功能受到抑制。搜集GenBank中关于等孢球虫卵囊18S rRNA基因相关数据,应用计算机软件设计Nested PCR引物,针对等孢球虫卵囊18S rRNA基因建立Nested PCR扩增方法。实验表明,实验中设计的两套PCR引物都可以从大量卵囊中扩增出目的DNA片断,并且可以从相当于低于1个卵囊的DNA稀释样品中提取出目的片断,表明引物具有较高的敏感性。用第二套引物检查采自猪场的粪便,以麦克马斯法作对照,结果表明第二套引物在从粪便中提取DNA时特异性强于第一套引物,且PCR方法敏感性高于传统的麦克马斯法。用阴性粪便与一定数量猪等孢球虫卵囊混匀进行试验表明,巢式PCR引物可以从粪便中直接扩增微量卵囊的DNA,表明该方法可从阳性粪便所提DNA中扩增出目的基因片段。设计五种适合于从微量卵囊中提取DNA的方法分别为:十六烷基三甲基溴化铵(CTAB法)法、氯化苄法(BC法)、TritonX-100和Tris-HCI等量混合提取法(TT法)、DNA提取试剂盒提取(MK法)、改进DNA提取试剂盒提取(MMK法)。比较了五种方法对微量卵囊DNA提取效果,其结果用第二套引物验证,并用分光光度计测量其DNA的含量及纯度。结果表明十六烷基三甲基溴化铵法所提取的卵囊DNA量最大,TritonX-100和Tris-HCI等量混合提取法次之,之后为DNA提取试剂盒法及改进DNA提取试剂盒提取法。氯化苄法不能提取出卵囊DNA。用分光光度计及第二套引物对所提取的DNA质量的检测结果一致,表明所选取的DNA提取方法可以用于提取卵囊DNA并且所提DNA也可用于下游实验。

关键词：猪等孢球虫排卵囊规律 T细胞亚群 18SrDNA 巢式PCR DNA提取方法

猪等孢球虫、贾第虫双重巢式PCR方法和隐孢子虫基于Lectin基因的PCR方法的建立

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猪等孢球虫、贾第虫双重巢式PCR方法和隐孢子虫基于Lectin基因的P...

作者：刘珍珍河南农业大学

学位级别：硕士

猪等孢球虫是猪场防治的主要寄生虫之一,对仔猪的致病性较强,常导致仔猪腹泻和体重降低。成年猪常呈隐性感染或携带者,可对仔猪健康造成潜在威胁,患病仔猪可继发其他肠道疾病,对发病猪场造成重大经济损失。贾第虫是另一种重要的肠道寄生... 详细信息

猪等孢球虫是猪场防治的主要寄生虫之一,对仔猪的致病性较强,常导致仔猪腹泻和体重降低。成年猪常呈隐性感染或携带者,可对仔猪健康造成潜在威胁,患病仔猪可继发其他肠道疾病,对发病猪场造成重大经济损失。贾第虫是另一种重要的肠道寄生虫,具有人兽共患性。其感染猪病例已被很多国家报道,表明贾第虫病猪可作为十二指肠贾第虫感染人的传播来源。对猪场进行贾第虫和猪等孢球虫感染的调查,在防控猪的两虫病上有重要意义。目前,对这两种寄生虫的检查常用的是显微镜形态学检测和单病原PCR检测。传统的显微镜检测方法对操作者技术水平和经验有较高要求,且阳性检出率不高;而PCR检测法虽然灵敏度高但同时检测多个病原时,却需对一份样品多个虫种不同基因位点分别扩增和检测,耗时费力。故寻找一种能同时检测出两种虫的灵敏度高的双重PCR检测方法,可有效地提高检测效率。因此,本研究分别针对贾第虫GDH基因和猪等孢球虫SSU rRNA基因,建立并优化了一套灵敏度高、特异性强的双重巢式PCR方法,并使用该方法对我国河南省部分地区猪场的猪等孢球虫和贾第虫感染情况进行了流行病学调查,为了解猪等孢球虫和贾第虫在猪场中的流行情况提供了理论依据。隐孢子虫是另一种重要的人兽共患性原虫,主要引起肠胃炎和急慢性腹泻,世界各地广泛流行。现有的隐孢子虫基因分型和亚型分型工具已将隐孢子虫分为36个种,70多个基因型,但仍有其局限性。对于和人隐孢子虫(C.hominis)SSU rRNA基因相似的兔隐孢子虫(C.cuniculus)、horse genotype、donkey genotype、来自袋鼠的与C.hominis完全相似的隐孢子虫,及其人和不同动物来源的C.parvum之间的区分依靠现有的分型工具,仍难以区分出动物来源和不同虫株间的差异。而Lectin基因作为分型工具时发现不同隐孢子虫种类在该位点的序列不同,尤其是不同种隐孢子虫有数量不等的CAA三联密码子重复序列。根据其他原虫相关研究,如溶组织阿米巴凝集素蛋白对阿米巴致病力的影响,推测该基因编码的蛋白可影响隐孢子虫的入侵、繁殖和致病力。因此,该基因位点极有可能成为人兽共患隐孢子虫的分类和遗传研究的有效得力的工具。1猪等孢球虫和贾第虫双重巢式PCR检测方法的建立和应用为同步检测引起猪腹泻的猪等孢球虫和贾第虫这两种重要的肠道寄生虫,本研究分别针对猪等孢球虫SSU rRNA基因和贾第虫GDH基因建立并优化了一套双重巢式PCR方法。结果显示:双重巢式PCR对GDH和SSU rRNA扩增的产物大小分别为432bp和530bp。该双重巢式PCR对贾第虫和猪等孢球虫的敏感性分别为5.51pg·μL和385fg·μL,表明该双重巢式PCR的敏感性较高。临床检测:用优化好的双重巢式PCR对53份临床样品进行检测,结果显示:双重巢式PCR扩增猪等孢球虫阳性率为20.7%(11/53),贾第虫阳性率为5.7%(3/53),混合感染阳性率为3.8%(2/53);单病原PCR检测与双重巢式PCR检测结果相差不大,无统计学意义(P>0.05)。该双重巢式PCR方法可以用来对猪十二指肠贾第虫和猪等孢球虫进行快速准确地检测。2河南省部分地区猪等孢球虫和贾第虫的分子流行病学调查为了解河南省部分地区猪等孢球虫和贾第虫的分子流行情况,共采集212份猪粪便样品,分别采用单巢式PCR方法和本试验所建立的双重巢式PCR方法特异性扩增猪等孢球虫SSU rRNA基因和贾第虫GDH基因片段。结果显示,猪等孢球虫和贾第虫的总体阳性率为25.9%(55/212),猪等孢球虫的总感染率为20.3%(43/212),贾第虫的总感染率为5.7%(12/212),两种虫的混合感染率为2.8%(6/212)。所有场都至少感染一种虫种。仔猪阶段猪等孢球虫和贾第虫的感染率最高35.8%(39/109),育肥猪阶段最低3.4%(1/29),表明不同年龄段间猪等孢球虫和贾第虫感染情况差异较大;正阳县某猪场猪等孢球虫和贾第虫的总阳性率最高为45.5%(5/11),许昌市某猪场的阳性率最低为17.9%(7/39),表明不同地区猪等孢球虫和贾第虫的感染差异较大。以上结果表明,猪等孢球虫和十二指肠贾第虫在我国猪场中猪的感染率较高,分布较为广泛,需进行更深入的流行病学调查,以期为猪等孢球虫病和贾第虫病的防控提供合理的实验依据。3隐孢子虫基于Lectin基因PCR鉴定方法的建立为了解隐孢子虫凝集素基因在不同分离株的序列差异及其遗传进化关系,以SSU rRNA基因作参照,评价Lectin基因位点作为隐孢子虫基因分型和进化关系分析的可行性。对实验室分离保存的多份隐孢子虫分离株分别在Lectin和SSU rRNA位点处采用巢式PCR方法进行扩增。并用ClustalX对扩增序列与参考序列进行比对,用MEGA5中的邻近法(Neighborjoiningmethod NJ),进行进化树的构建。结果显示:基于Lectin基因位点,在C

关键词：猪等孢球虫十二指肠贾第虫隐孢子虫 SSU rRNA基因 GDH基因 Lectin基因双重巢式PCR 流行病学调查基因分型工具

猪等孢球虫粪便检测方法的改良与特异PCR方法的建立

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猪等孢球虫粪便检测方法的改良与特异PCR方法的建立

作者：李亮华南农业大学

学位级别：硕士

猪球虫病是寄生于猪肠道上皮细胞的艾美耳属球虫和等孢属球虫引起,以腹泻和消瘦为主要症状。国内外报道的猪球虫种类较多,经形态学和特异PCR方法鉴定,目前有10种艾美耳球虫和1种等孢球虫被确认为有效种。不同品种和生长阶段的猪均能感... 详细信息

猪球虫病是寄生于猪肠道上皮细胞的艾美耳属球虫和等孢属球虫引起,以腹泻和消瘦为主要症状。国内外报道的猪球虫种类较多,经形态学和特异PCR方法鉴定,目前有10种艾美耳球虫和1种等孢球虫被确认为有效种。不同品种和生长阶段的猪均能感染猪球虫,其中哺乳期仔猪对猪等孢球虫(Isospora suis)的易感性最高,临床常出现水样腹泻,而其他阶段的猪则多为隐性感染。猪等孢球虫流行广泛,给养殖业带来巨大的经济损失。解决等孢球虫病问题,首先应从诊断开始,常规诊断方法存在检测率低等诸多问题。因此,本研究通过传统猪球虫检测方法的改良和猪等孢球虫18SrRNA基因序列的特异PCR方法的建立,探索检测率高,操作简便的检测方法。猪球虫检测方法常用的是饱和盐水漂浮法。但饱和盐水漂浮法用到乳猪的球虫检测时,存在很多问题。产生问题的原因是,乳猪阶段营养来源完全靠母乳,此阶段由于猪的消化系统发育不完全再加上体抗力弱,消化道很容易损伤,消化道损伤导致肠道不能完全吸收脂肪、蛋白质等营养物质,从而粪便成分常常含有未吸收完全的蛋白质、脂肪等物质。当使用饱和盐水漂浮法检测猪球虫时,由于蛋白质盐析和脂肪一同漂浮于液表,影响镜检时的观察视野。因此,本研究利用猪球虫在高比重溶液可被漂浮的原理,选用尿素作为溶质的漂浮法取代现临床上惯用的饱和食盐水漂浮法,饱和尿素溶液的比重与饱和食盐水相当,且能使蛋白质变性,同时使用皂粒(主成分为高级脂肪酸纳)除去脂肪,再用硅酸盐除泡剂解决检测过程的气泡问题。在临床模拟实验中,发现改良漂浮法观察到的卵囊数远远多于饱和食盐水漂浮法(近20倍);通过对三个猪场进行检测临床检测发现,阳性率分别由5%,5%和10%提高至35%,25%和33%。结果表明,该方法有效除去了仔猪粪便中大多数脂肪以及蛋白质,从而有效消除了脂肪与蛋白质对镜检视野的影响,使镜检视野更为清晰,提高了检测率。本研究建立了特异性PCR方法检测猪等孢球虫。以猪等孢球虫18SrRNA基因序列设计特异引物,通过温度优化试验筛选出最佳温度为55.3°C;用猪艾美耳球虫,鸡柔嫩艾美耳球虫、犬等孢球虫、弓形虫、链球菌、大肠杆菌、魏氏梭菌、贝氏隐孢子虫等样本DNA作为对照进行特异性试验,猪等孢球虫可由特异性引物扩出条带,而对照样本的DNA和阴性对照不能被扩增;猪等孢球虫特异性引物CTS-5F/CTS-5R其敏感性最低可检测到3个卵囊。研究结果表明该方法敏感度高,可快速、特异地检测猪等孢球虫感染。应用饱和盐水漂浮法、改良粪便检测方法(皂粒粉+尿素+除泡剂)与特异PCR检测方法对临床样品进行检测比较,改良的粪检方法可弥补解决传统粪检方法的不足,在用漂浮法检测猪球虫方面,检测率明显有了很大的提高。但用改良的粪检方法与特异PCR检测方法实验对比时发现,由于建立的特异PCR检测方法有较好的特异性和敏感性,检测率高于改良粪检漂浮法,因此从检测率的角度特异PCR检测方法明显优于粪检漂浮法。等孢球虫检测方法的改良和检测效率的提高有利于掌握该病的感染情况和流行动态,为正确使用药物、及时治疗提供有效依据,对有效控制猪球虫病具有重要的指导意义。

关键词：猪等孢球虫漂浮法特异PCR方法