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抗炎因子IL-1Ra与猪种布鲁氏菌s2胞内寄生关系的研究

抗炎因子IL-1Ra与猪种布鲁氏菌S2胞内寄生关系的研究

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作者：战俊澎吉林大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性胞内寄生菌,它所引起的布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种人兽共患病,严重危害人类公共卫生安全和畜牧业健康发展。白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-1受体拮抗因子(Interleukin-1Ra,IL-1Ra... 详细信息

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性胞内寄生菌,它所引起的布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种人兽共患病,严重危害人类公共卫生安全和畜牧业健康发展。白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-1受体拮抗因子(Interleukin-1Ra,IL-1Ra)是白介素-1(Interleukin-1)家族的主要成员。病原微生物感染能诱导宿主大量分泌IL-1β,IL-1Ra与其竞争结合细胞表面的IL-1R(白介素-1受体),特异性地拮抗IL-1β的生物学功能,发挥调节炎症反应的作用。IL-1Ra作为主要的抗炎细胞因子,参与机体免疫反应。本课题组前期研究发现布鲁氏菌弱毒株猪种布鲁氏菌s2(*** s2)与野毒株羊种布鲁氏菌(***)感染可引起IL-1β和IL-1Ra两个基因的差异表达,且IL-1Ra与IL-1β的比值对区分布病自然感染和疫苗免疫的动物具有一定的指示意义。但尚不清楚IL-1Ra在布鲁氏菌致病过程中发挥的作用。因此,本研究分析了IL-1Ra与猪种布鲁氏菌s2株胞内寄生的关系,对进一步探讨布鲁氏菌感染宿主反应分子机制具有一定的科学意义。本研究首先克隆小鼠IL-1Ra成熟蛋白编码核酸序列,利用原核表达系统,诱导表达IL-1Ra重组蛋白并进行纯化,通过IL-1β活性抑制实验证明获得的IL-1Ra重组蛋白具有生物活性。其次通过猪种布鲁氏菌s2等细菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用Western Blot、实时荧光定量PCR、ELIsA等技术分析胞内和胞外IL-1Ra差异表达特点,同时监测胞内活菌数变化。结果显示:s2侵染巨噬细胞,IL-1Ra胞内蛋白表达量显著上调,胞外分泌量显著增加,而胞内细菌数呈先下降后上升的变化趋势。然后通过干扰IL-1Ra表达、IL-1Ra过表达和胞外添加活性IL-1Ra重组蛋白,降低或提高IL-1Ra蛋白含量水平,监测胞内活菌数变化,分析改变IL-1Ra蛋白含量水平对猪种布鲁氏菌s2胞内寄生的影响。结果显示:提高IL-1Ra蛋白含量水平抑制s2的胞内寄生,而降低IL-1Ra蛋白表达水平促进s2的胞内寄生。最后为了进一步分析IL-1Ra对s2胞内寄生的影响是否与IL-1β相关。本研究克隆小鼠IL-1β成熟蛋白编码核酸序列,利用原核表达系统,获得有活性的IL-1β重组蛋白。通过胞外添加活性IL-1β重组蛋白和干扰IL-1β表达,提高或降低IL-1β蛋白含量水平,分析胞内活菌数以及s2侵染IL-1β或IL-1Ra敲低巨噬细胞的部分细胞因子转录水平变化。结果显示:IL-1β与s2的胞内寄生未见明显相关性。s2侵染IL-1β敲低巨噬细胞,IL-1Ra、TNF的表达量均显著下调,IL-10的表达量显著上调;而s2侵染IL-1Ra敲低巨噬细胞,TNF、IL-10的表达量均显著下调,IL-6、IL-1β的表达量显著上调。提示IL-1Ra对s2的胞内寄生的抑制作用可能不是通过抑制IL-1β的生物学活性而实现的,可能需要不同的细胞因子参与。综上所述,本研究发现猪种布鲁氏菌s2侵染巨噬细胞引起宿主抗炎因子IL-1Ra显著上调表达和胞外分泌量增加,且IL-1Ra不利于s2的胞内寄生。进一步分析发现IL-1Ra对s2胞内寄生的抑制作用与其抑制IL-1β的生物学活性无明显相关性,为深入探讨IL-1Ra影响布鲁氏菌胞内生存机制以及能否以IL-1Ra作为靶标有效地预防和治疗布鲁氏菌病提供一定的科学依据。

关键词： IL-1Ra IL-1β 猪种布鲁氏菌s2 巨噬细胞胞内寄生

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宿主Prdx6促进布鲁氏菌胞内寄生与细胞铁死亡关系的研究

宿主Prdx6促进布鲁氏菌胞内寄生与细胞铁死亡关系的研究

引用

作者：程梦妍吉林大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病（Brucellosis,简称布病）,是由布鲁氏菌（Brucella spp.）引起的一种危害严重的人兽共患传染病,该病在世界范围内广泛流行,对畜牧业造成重大经济损失,严重威胁人类健康和公共卫生安全。目前,布鲁氏菌的胞内生存和免疫逃逸机... 详细信息

布鲁氏菌病（Brucellosis,简称布病）,是由布鲁氏菌（Brucella spp.）引起的一种危害严重的人兽共患传染病,该病在世界范围内广泛流行,对畜牧业造成重大经济损失,严重威胁人类健康和公共卫生安全。目前,布鲁氏菌的胞内生存和免疫逃逸机制尚未完全明确。本课题组前期研究发现宿主多功能酶Prdx6有助于猪种布鲁氏菌s2菌株（*** s2）在巨噬细胞和睾丸支持细胞（TM4）内的胞内寄生,且与过氧化物酶（GPx）活性相比,磷脂酶A2（PLA2）活性对布鲁氏菌在巨噬细胞内的生存更为重要。研究发现Prdx6对铁死亡具有重要的调节作用。铁死亡是一种铁依赖性的,区别于其他细胞死亡方式的新型细胞程序性死亡方式。目前关于布鲁氏菌与细胞铁死亡之间的研究报道较少。本研究在Prdx6促进布鲁氏菌胞内寄生的基础上,探讨Prdx6是否可通过调节细胞铁死亡的方式影响布鲁氏菌的胞内寄生。首先探究*** s2感染是否引起TM4细胞铁死亡。以*** s2感染TM4细胞,分析不同感染复数（MOI）和不同感染时间对细胞铁死亡的影响,检测细胞活性、细胞内活性氧（ROs）、Fe2+、脂质过氧化（MDA）和GsH含量,以及铁死亡相关分子的表达水平。结果发现*** s2感染TM4细胞能显著降低细胞活性,增加细胞内ROs、Fe2+、MDA水平,降低GsH含量并下调Gpx4和slc7a11的m RNA转录以及蛋白表达,且呈MOI依赖性。为进一步明确铁死亡在*** s2感染中的作用,给予细胞铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）,通过平板计数分析抑制细胞铁死亡是否影响布鲁氏菌的胞内寄生。结果发现,Fer-1可抑制*** s2感染引起的细胞活性降低、Fe2+超载、ROs累积、GsH消耗、脂质过氧化以及Gpx4和slc7a11蛋白表达下调;并增加布鲁氏菌胞内寄生数量。但是这种铁死亡特征性的细胞变化在感染24 h后被抑制。以上说明*** s2感染能够引发细胞铁死亡,但在24 h后表现为抑制铁死亡。其次探究Prdx6在*** s2感染引起的细胞铁死亡中的作用。通过构建Prdx6过表达和敲除细胞系,分析铁死亡相关指标变化,探究Prdx6差异表达对布鲁氏菌感染引起的细胞铁死亡以及胞内寄生的影响。结果发现过表达Prdx6可抑制*** s2感染引起的细胞铁死亡,增加布鲁氏菌胞内寄生数量。敲除Prdx6加剧*** s2感染引起的细胞铁死亡并且抑制布鲁氏菌胞内寄生。说明Prdx6负调控*** s2引起的细胞铁死亡有助于其胞内寄生。Prdx6具有多种酶活性,其中最主要的是过氧化物酶活性和磷脂酶A2活性。为进一步探究Prdx6这两种主要酶活性在调控*** s2引起的细胞铁死亡中的作用,以Prdx6的PLA2活性抑制剂MJ33和Prdx6的GPx活性抑制剂Mercaptosuccinate处理*** s2感染的细胞,检测细胞内ROs和MDA的变化水平以及*** s2胞内寄生数量。结果发现,MJ33可以显著增加*** s2感染引起的ROs和MDA含量,减少布鲁氏菌胞内寄生数量;并且Fer-1可以抑制MJ33引起的细胞ROs和MDA含量的增加,增加布鲁氏菌胞内寄生数量。说明Prdx6可通过PLA2活性负调控细胞铁死亡促进布鲁氏菌胞内寄生。综上所述,本研究发现*** s2感染能引起TM4细胞铁死亡,宿主Prdx6负调控*** s2感染引起的细胞铁死亡,抑制Prdx6的PLA2活性促进细胞发生铁死亡,使布鲁氏菌胞内寄生数量减少。因此,Prdx6能够以PLA2活性负调控*** s2感染引起的细胞铁死亡,有助于布鲁氏菌的胞内寄生。本研究进一步丰富和完善布鲁氏菌感染机制的调控网络,为布鲁氏菌病的防治提供新思路和新靶点。

关键词：猪种布鲁氏菌s2 铁死亡 Prdx6 胞内寄生

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