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作者：龚恒林福建师范大学

学位级别：硕士

生物安全性是伪狂犬病病毒株疫苗研发的根本。在细胞水平上,对TK、gE基因单敲除和双敲除毒株进行先天免疫应答、细胞凋亡等过程的分析是评估疫苗安全性的重要环节,构建基因敲除细胞株可为研究抗病毒天然免疫应答提供必要的细胞模型。为... 详细信息

生物安全性是伪狂犬病病毒株疫苗研发的根本。在细胞水平上,对TK、gE基因单敲除和双敲除毒株进行先天免疫应答、细胞凋亡等过程的分析是评估疫苗安全性的重要环节,构建基因敲除细胞株可为研究抗病毒天然免疫应答提供必要的细胞模型。为了成功建立Tlr3、Tlr7、Stat6、Rig1等基因缺失细胞株,本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑技术平台,通过脂质体转染技术成功地将用于基因敲除重组PX459质粒(含有Cas9蛋白的编码序列和嘌呤霉素抗性基因)导入pk-15细胞中,并用2μg/mL的Puromycin溶液筛选出含有嘌呤霉素抗性的pk-15细胞。待筛选后的细胞生长至汇合度至80%以上时,取部分细胞抽提基因组并对相关基因PCR测序,在对确认发生基因编辑的混合细胞株进行有限稀释法后,分离的单克隆细胞株进行T-A克隆测序验证,筛选出阳性单克隆细胞株。之后对阳性单克隆细胞进行蛋白水平验证,最终成功得到四种基因敲除的细胞株,并将其命名为pk-15-Rig1-/-、pk-15-Tlr3-/-、pk-15-Tlr7-/-、pk-15-Stat6-/-。本次实验分别用野生型PRV以及PRV-TK-、PRV-gE-、PRV-TK-/gE-三种基因缺失型毒株对pk-15-Tlr3-/-、pk-15-Tlr7-/-、pk-15-Stat6-/-这三种基因敲除细胞依次进行侵染实验。通过分析Tlr3-/-、Tlr7-/-、Stat6-/-这三种基因缺失型细胞在病毒侵染后IFN-β、IFIT1、CXCL10、IL-6及Bcl-2这5个细胞因子的变化情形,得出如下结论:不管gE和TK基因是否被敲除,伪狂犬病病毒株侵染宿主(细胞)均会激活Tlr3、Tlr7所介导的抗病毒天然免疫通路,但是gE和TK基因缺失会下调该通路中干扰素的表达;gE和TK在抗病毒天然免疫反应中同Stat6存在某种拮抗作用关系;gE和TK基因在抑制细胞自我保护方面可能存在某种机制的拮抗作用。上述结果表明,本实验室构建的基因缺失弱毒株的生物安全性较野毒株有所改善,但还需要进行动物实验以确保其安全性。

关键词：猪狂犬病病毒 CRISPR/Cas9 TK gE 疫苗 pk-15细胞

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