检索结果-南通市图书馆

作者：余迮艳秋南京农业大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的仔猪腹泻疾病,其临床症状常表现为仔猪腹泻、呕吐、脱水直至死亡,给全世界养猪业造成了重大损失。PEDV是有囊膜病毒的单股正链RNA 病毒,基因组结构依次为,5’UTR-ORF1a/b-S-E-ORF3-M-N-3’... 详细信息

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的仔猪腹泻疾病,其临床症状常表现为仔猪腹泻、呕吐、脱水直至死亡,给全世界养猪业造成了重大损失。PEDV是有囊膜病毒的单股正链RNA 病毒,基因组结构依次为,5’UTR-ORF1a/b-S-E-ORF3-M-N-3’UTR。PEDV在临床流行和细胞传代过程中,基因组不断变异,其中纤突蛋白(S)具有较好的免疫原性。干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs)是干扰素发挥抗病毒作用的主要效应物,并且在针对微生物感染的先天免疫防御中起到主要作用,尤其在病毒感染期间,ISGs的抗病毒作用可以有效控制病毒的复制和传播。2’-5’寡腺苷酸合成酶样蛋白(2’-5’oligoadenylate synthetase-like,OASL)可由干扰素诱导产生,在干扰素介导的抗病毒固有免疫中发挥重要作用。1基于转录组分析筛选抗PEDV复制的ISGs分析PEDV 85-7亲本株和C40细胞传代株的生长曲线,发现C40株在干扰素缺陷型Vero细胞上复制滴度显著高于亲本株,而在干扰素正常表达MARC-145细胞上,滴度却显著低于亲本株,并且C40株可以诱导MARC-145细胞产生Ⅰ型干扰素,采用转录组分析比较两株PEDV诱导的ISGs差异,经qPCR验证,OASL、RSAD2、USP18、ISG15、TRIM16、STAT2、ATF1、IFIT2、IFIT3、IFIT5、IFI16和IFI35 等基因的表达存在差异,利用pEGFP-N1质粒构建了上述12个基因的重组质粒,并分别转入MARC-145细胞中,瞬时过表达蛋白后接种PEDV 24h后,用空斑试验检测细胞上清病毒量,qPCR检测细胞内病毒复制水平,结果表明OASL、RSAD2、STAT2能使病毒量下降约60%;ISG15、TRIM16、IFIT2使病毒量下降约50%,证实OASL、RSAD2、STAT2、ISG15、TRIM16和IFIT2是抗PEDV复制的ISG分子,同时暗示这些ISGs的上调表达是造成C40细胞传代株与85-7亲本株生长特性差异的重要原因之一。2 OASL蛋白抑制PEDV复制的机制初步研究进一步研究OASL的抗病毒机制,发现瞬时过表达OASL后能够显著抑制PEDV在MARC-145细胞上的增殖,与之对应的是利用siRNA干扰技术瞬时沉默OASL可以促进PEDV的增殖,证明OASL对PEDV的复制具有抑制作用。通过共转染OASL和si RNase L,发现沉默RNase L并不影响OASL的抗PEDV作用,证明OASL抗病毒作用并不依赖于经典的OAS/RNase L途径。过表达OASL可以显著提高IFN-α转录水平,沉默OASL则下调IFN-α转录水平,并且发现在干扰素缺陷型Vero细胞上过表达OASL并不发挥OASL的抗PEDV作用。随后通过Co-IP试验证明了 OASL与RIG-1有直接互作,而非MDA5,另外共表达OASL和RIG-1同样可以促进IFN-α转录水平。提示OASL可作为抗PEDV的ISG分子,并且是通过RIG-1介导的Ⅰ型干扰素途径发挥抗病毒作用,而非经典的OAS/RNase L途径,有助于进一步阐明宿主先天免疫对抗PEDV感染机制。3猪流行性腹泻病毒中和位点原核表达及抗体制备利用生物学软件,预测了 PEDV S1蛋白中可能包含中和线性表位的区域,命名为S582;参考PEDV经典株CV777中已证实的中和表位,预测了 3个含有相应中和表位的截断片段,命名为COE、894和CSS。分别扩增PEDV 85-7亲本株和311-1病料分离株中这4种目的片段。构建含有该目的基因的pET-32a重组质粒,蛋白纯化得到高浓度的S582蛋白,免疫新西兰大白兔,免疫4次后,Protein A/G纯化得到兔多克隆抗体。结果表明,该免疫血清效价达到1:128,000,但无中和效价,说明此S582序列并不包含PEDV线性中和表位。

关键词：猪流性腹泻病毒 ISGs OASL 中和表位

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同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

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中国兽医学报 2023年第3期43卷 448-454,461页

作者：高艺祥王金凤张倩孙晓霞刘立兵顾文源马宏伟韩庆安马增军王建昌石家庄海关技术中心河北石家庄050051 河北科技师范学院动物科技学院河北省预防兽医学重点实验室河北秦皇岛066004 河北省动物疫病预防控制中心河北石家庄050035

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10^(3),1.13×10^(3),1.31×10^(2)和1.18×10^(2)拷贝;重复性好,组内和组间试验变异系数均小于4.5%。进一步应用所建立的同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法对199份采集自河北省不同地区腹泻猪的临床样品进行检测,结果检出23份PoRV阳性(11.56%)、12份PEDV阳性(6.03%)和1份TGEV阳性(0.50%),均为单一感染;未检出PDCoV阳性。本研究所建立的四重实时荧光RT-PCR检测方法可实现对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的同时鉴别检测,为实验室快速鉴别诊断猪病毒性腹泻提供了有效的技术支持。

关键词：猪德尔塔冠状病毒猪传染性胃肠炎猪轮状病毒猪流性腹泻病毒四重实时荧光RT-PCR

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