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畜牧兽医学报 2009年第7期40卷 1054-1058页

作者：张建民吴斌赵战勤卢顺何华向敏李利娅张福涛陈焕春华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华南农业大学兽医学院广州510642

本研究旨在建立猪水肿毒素抗体的快速检测方法。以纯化的猪水肿毒素A亚基基因片段的原核表达产物作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和猪水肿毒素A亚基单抗酶结合物建立了竞争ELISA方法检测猪水肿毒素抗体。经过研究确定抗... 详细信息

本研究旨在建立猪水肿毒素抗体的快速检测方法。以纯化的猪水肿毒素A亚基基因片段的原核表达产物作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和猪水肿毒素A亚基单抗酶结合物建立了竞争ELISA方法检测猪水肿毒素抗体。经过研究确定抗原包被浓度为0.32μ***-1,待检血清最佳稀释度为1∶2,酶标单抗工作浓度为1∶3200,血清抑制率大于40%为阳性。应用单抗竞争ELISA和细胞毒性中和试验同时对60份血清进行猪水肿毒素抗体检测,竞争ELISA的检出率为33.8%,细胞毒性中和试验检出率为30.9%,两者符合率达88.2%。试验结果表明,该ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。本方法的建立在实验室诊断的标准化、猪水肿病疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有较高的应用价值。

关键词：猪水肿毒素单克隆抗体单抗竞争ELISA 抗体检测

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猪水肿毒素A亚基基因表达产物的生物学特性及抗体检测ELISA方法的建立

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农业生物技术学报 2007年第3期15卷 378-382页

作者：赵战勤卢顺吴斌刘国平张建民何华何启盖金梅林陈焕春武汉430070 华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室

根据TMpred生物学软件对SLT-ⅡeA亚基的蛋白质结构分析结果,表达了猪水肿毒素(SLT-Ⅱe)A亚基。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达产物以可溶形式存在,易于纯化且具有良好免疫学活性。生物学毒性试验表明,表达产物不能致死小白鼠,也... 详细信息

根据TMpred生物学软件对SLT-ⅡeA亚基的蛋白质结构分析结果,表达了猪水肿毒素(SLT-Ⅱe)A亚基。SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达产物以可溶形式存在,易于纯化且具有良好免疫学活性。生物学毒性试验表明,表达产物不能致死小白鼠,也不具有Vero细胞毒性。体外细胞毒性中和试验表明,表达产物的兔抗血清能中和天然SLT-Ⅱe(中和度90.4℅)。在小鼠免疫保护力试验中,表达产物作为免疫原不能提供任何保护力。以表达产物为抗原建立检测SLT-Ⅱe抗体的间接ELISA方法,结果该方法对猪萎缩性鼻炎等9种常见细菌性疾病阳性血清的检测均为阴性,能特异性检测到人工感染猪水肿毒素8d仔猪的血清抗体IgG,对临床送检的1083份猪血清的检测阳性率为20.9℅。

关键词：猪水肿病猪水肿毒素生物学特性 ELISA

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猪水肿毒素A亚基单抗的制备及竞争ELISA检测方法的建立

猪水肿毒素A亚基单抗的制备及竞争ELISA检测方法的建立

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作者：张建民华中农业大学

学位级别：硕士

猪水肿病(Porcine Edema disease,ED)是常见的一种仔猪急性、致死性传染病,是由某些特定血清型的大肠杆菌引起的肠毒血症。该病的直接致病因子是产志贺样毒素大肠杆菌(Shiga-like toxigenic ***,SLTEC)产生的一种志贺样毒素Ⅱ型变异体(S... 详细信息

猪水肿病(Porcine Edema disease,ED)是常见的一种仔猪急性、致死性传染病,是由某些特定血清型的大肠杆菌引起的肠毒血症。该病的直接致病因子是产志贺样毒素大肠杆菌(Shiga-like toxigenic ***,SLTEC)产生的一种志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shiga-like toxinⅡe,SLT-Ⅱe),又称猪水肿毒素。SLT-Ⅱe的分子结构由一个A亚单位和5个B亚单位组成。SLT-Ⅱe通过其B亚单位与猪肠上皮细胞的特异性受体发生结合,介导A亚单位进入细胞核糖体,其A1亚基与核糖体大亚基28SrRNA发生接触反应阻止氨酰tRNA与核糖体RNA结合,从而阻断细胞内蛋白质的合成,导致细胞死亡。因此,SLT-Ⅱe是该菌致病性的重要物质基础,是制备毒素的特异性抗体理想的靶抗原。鉴于猪水肿病是一种造成断奶仔猪死亡并在世界范围内广泛存在的重要疾病。对猪群的血清学检测以及疫苗免疫是预防和控制该病的关键,然而目前为止,市面上还没有商品化的疫苗及血清学检测方法。本实验室研究生已经分别克隆表达了猪水肿毒素A亚基和B亚基,利用纯化的蛋白建立了间接ELISA方法,但是该方法采用大肠杆菌的融合表达蛋白含有大肠杆菌蛋白,在临床应用上常会产生假阳性的结果,因此需要进行改进。本研究就是利用猪水肿病大肠杆菌SLT-ⅡeA表达蛋白制备其单克隆抗体,旨在建立检测猪水肿毒素抗体的单抗竞争ELISA方法,具体研究情况如下: 1.猪水肿毒素A亚基单克隆抗体的制备及鉴定以纯化的猪水肿毒素A亚基基因片段的原核表达蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选,采用有限稀释法对其进行克隆,最终获得10株能稳定分泌抗猪水肿毒素A亚基蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E12、2G11、5812、2E3、4F4、4G2、1A10、4A7、4812、3H7。细胞培养上清ELISA效价为2×100～2×100,腹水ELISA效价可达2×100～2×100。与蛋白亲和力试验表明,这10株单抗具有较高的亲和力。Western-blot结果表明,10株单抗都可以与表达蛋白反应,其中有8株单抗可以与天然水肿毒素反应。Vero细胞中和试验表明,只有3H7和4G2具有一定的中和活性。 2.竞争ELISA方法的建立和初步应用本研究以辛酸—硫酸铵法纯化3H7单抗腹水,以改良过碘酸钠法标记纯化的3H7单抗,制备酶标单克隆抗体。以原核表达蛋白SLT-ⅡeA为抗原,以酶标单抗为检测抗体,建立检测猪水肿毒素抗体的单抗竞争ELISA方法。用方阵滴定确定蛋白包被浓度为0.32μg/mL,酶标单抗的工作浓度为1:3200,血清稀释度为1:2,通过检测30份阴性血清,120份阳性血清,确定血清抑制率大于40%判定为阳性。特异性、重复性及临床试验结果表明,该方法特异性强、重复性好、稳定性高。本实验通过单克隆抗体制备的常规技术,获得针对猪水肿毒素A亚基的抗体,用纯化的单抗和HRP进行标记,获得可以与阳性血清竞争的酶标抗体。同时,对影响ELISA试验的主要因素进行了摸索,对研制的诊断试剂盒的特异性、敏感性、重复性等进行研究和探索,为下一步试剂盒的应用打下了基础。

关键词：大肠杆菌猪水肿毒素单克隆抗体竞争ELISA

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