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猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、血清分型及耐药性分析

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中国兽医学报 2023年第5期43卷 930-936页

作者：张哲玮曹维维代小童甘晶饶静袁龙贝为成华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室湖北武汉430070 湖北洪山实验室湖北武汉430070 广西扬翔农牧有限责任公司广西贵港537100 生猪健康养殖协同创新中心湖北武汉430070

为了探究猪多杀性巴氏杆菌在规模化养猪场的流行情况,对来自广西、湖北、内蒙古3个地区规模化猪场中有呼吸道症状猪的口鼻拭子及组织病料进行病原菌的分离培养、染色镜检、生化鉴定及PCR检测鉴定。结果显示,分离得到6株猪多杀性巴氏杆菌... 详细信息

为了探究猪多杀性巴氏杆菌在规模化养猪场的流行情况,对来自广西、湖北、内蒙古3个地区规模化猪场中有呼吸道症状猪的口鼻拭子及组织病料进行病原菌的分离培养、染色镜检、生化鉴定及PCR检测鉴定。结果显示,分离得到6株猪多杀性巴氏杆菌,其中血清A型1株(命名为GX-PmA),血清D型5株(命名为GX-PmD1、GX-PmD2、GX-PmD3、GX-PmD4、NMG-PmD5)。耐药性分析结果显示,GX-PmD1、GX-PmD2、GX-PmD3、GX-PmD4未见耐药现象,而NMG-PmD5表现出明显的新霉素及庆大霉素耐药现象。小鼠致病性分析发现血清A型菌株毒力显著强于血清D型菌株,且PmA和GX-PmD4菌株对小鼠的致病力明显强于其他分离菌株。综上,本研究对猪场猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及防治措施提供了科学依据和防控方案。

关键词：猪多杀性巴氏杆菌分离鉴定血清分型耐药性分析

猪多杀性巴氏杆菌OmpW、TbpA蛋白的原核表达及免疫原性研究

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中国畜牧兽医 2023年第4期50卷 1489-1498页

作者：张哲玮代小童韦祖丹陈云鹏甘晶贝为成华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉430070 湖北洪山实验室武汉430070 广西扬翔农牧有限责任公司贵港537100 生猪健康养殖协同创新中心武汉430070

【目的】研究猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白的免疫原性,探索其作为疫苗候选抗原的可能。【方法】对NCBI中不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中OmpW和TbpA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并对OmpW和TbpA蛋白进行生物信息学分析。基于此,构建... 详细信息

【目的】研究猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白的免疫原性,探索其作为疫苗候选抗原的可能。【方法】对NCBI中不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中OmpW和TbpA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并对OmpW和TbpA蛋白进行生物信息学分析。基于此,构建重组表达菌株pET28a-OmpW-BL21和pET28a-TbpA-BL21,重组OmpW和TbpA蛋白经镍柱亲和层析纯化后与氢氧化铝佐剂混匀制备亚单位疫苗,免疫小鼠后使用猪多杀性巴氏杆菌GX-PmD4菌株攻毒,评估OmpW和TbpA蛋白的免疫原性。【结果】相似性比对发现,OmpW和TbpA蛋白在不同血清群猪多杀性巴氏杆菌中高度保守;SignalP 6.0 Server和TMHMM Server v.2.0软件预测发现OmpW蛋白有信号肽和跨膜区,而TbpA蛋白有信号肽无跨膜区;ABCpred软件分析显示,OmpW和TbpA蛋白分别有14和22个B细胞抗原表位;SOPMA和SWISS-MODEL软件进一步预测蛋白结构表明:OmpW和TbpA蛋白的α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占16.18%、5.39%、36.76%、41.67%和40.42%、5.69%、16.77%、37.13%。经原核表达获得的重组OmpW和TbpA蛋白均具有较强的抗原性。在免疫小鼠后的14和28 d,与对照组相比,血清中OmpW、TbpA特异性抗体水平极显著上升(P猪多杀性巴氏杆菌OmpW和TbpA蛋白,且重组OmpW蛋白免疫原性较强,可作为猪多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的有效候选抗原。

关键词：猪多杀性巴氏杆菌 OmpW TbpA 表达免疫原性

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猪多杀性巴氏杆菌5：A型Ts-8株psl基因的克隆和序列分析

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河南农业科学 2008年第4期37卷 108-110,114页

作者：肖国生曹三杰黄小波文心田重庆三峡学院生物系重庆万州404000 四川农业大学动物医学院基因芯片实验室/动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川雅安625014

根据禽多杀性巴氏杆菌psl基因序列,设计了1对引物,从猪源多杀性巴氏杆菌5:A型Ts-8株中扩增出453bp的psl基因,将其克隆到pMD18-T载体后测序。序列分析表明,该基因与禽多杀性巴氏杆菌T16株的psl基因序列只相差2个碱基,同源性高达99%;与流... 详细信息

根据禽多杀性巴氏杆菌psl基因序列,设计了1对引物,从猪源多杀性巴氏杆菌5:A型Ts-8株中扩增出453bp的psl基因,将其克隆到pMD18-T载体后测序。序列分析表明,该基因与禽多杀性巴氏杆菌T16株的psl基因序列只相差2个碱基,同源性高达99%;与流感嗜血杆菌编码P6蛋白的基因序列同源性为83%。猪psl基因的推导氨基酸序列与禽psl基因、P6蛋白的氨基酸序列同源性分别为100%,87%。结果表明,多杀性巴氏杆菌psl基因在猪和禽的菌株中是高度保守的,而且与P6蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性。

关键词：猪多杀性巴氏杆菌 psl基因克隆序列分析

猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌双重及多重PCR检测方法的建立

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黑龙江畜牧兽医 2018年第8期 75-78页

作者：朱新贵田亚平王亚珊吴艳芳刘勇军姚强姜艳彬张锐利侯东军塔里木大学生命科学学院新疆阿拉尔843300 中国动物疫病预防控制中心北京100125 菏泽职业学院山东菏泽274031

为了准确检测临床上猪多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）和副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）的感染,根据Gen Bank中副猪嗜血杆菌16S rRNA、PILA、LIPO基因保守序列和猪多杀性巴氏杆菌的16S rRNA、KMT1基因保守序列建立双重... 详细信息

为了准确检测临床上猪多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）和副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）的感染,根据Gen Bank中副猪嗜血杆菌16S rRNA、PILA、LIPO基因保守序列和猪多杀性巴氏杆菌的16S rRNA、KMT1基因保守序列建立双重及多重PCR检测方法,通过对其退火温度的筛查,确定最优退火温度,然后进行方法的验证。结果表明：与传统方法相比,所建立的双重及多重PCR检测方法具有快速、准确度高、特异性强的特点。说明本方法可以用于猪多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌在临床上的快速检测。

关键词：猪多杀性巴氏杆菌副猪嗜血杆菌多重PCR 16S rRNA基因外毒素基因

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其OmpW、TbpA蛋白的克隆表达

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猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其OmpW、TbpA蛋白的克隆表达

作者：代小童华中农业大学

学位级别：硕士

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是一类败血性革兰氏阴性致病菌,可以感染多种动物,使其产生不同程度的损伤。在猪中主要引起猪肺疫和猪萎缩性鼻炎,给养猪业带来了巨大的危害。目前该病的防控主要依赖于药物治疗及疫苗免疫,... 详细信息

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是一类败血性革兰氏阴性致病菌,可以感染多种动物,使其产生不同程度的损伤。在猪中主要引起猪肺疫和猪萎缩性鼻炎,给养猪业带来了巨大的危害。目前该病的防控主要依赖于药物治疗及疫苗免疫,但随着抗生素的大量使用,耐药性问题愈加多见,这无疑加大了猪多杀性巴氏杆菌病预防控制的难度。因此,本实验通过收集临床发病猪的口鼻拭子及组织病料,对来自不同地区规模化养殖场的猪多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定及生物学特性分析,评估目前我国部分地区养殖场猪多杀性巴氏杆菌的优势血清型菌株;通过生物信息学分析发现在不同源性多杀性巴氏杆菌及猪源多杀性巴氏杆菌不同血清型菌株中存在高度保守的ompW、tbpA基因,通过原核表达对OmpW、TbpA蛋白进行克隆表达,为猪多杀性巴氏杆菌候选免疫原性蛋白提供基础。具体内容如下:1.猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定为了探究猪多杀性巴氏杆菌在规模化猪场的流行情况,首先对来自广西、湖北、内蒙古3个地区规模化猪场中患有呼吸道症状发病猪只的口鼻拭子及组织病料进行病原菌的分离培养、染色镜检、生化鉴定及PCR检测鉴定,结果显示分离得到6株多杀性巴氏杆菌,其中荚膜血清A型1株（命名为GX-Pm A）,荚膜血清D型5株（命名为GX-Pm D1、GX-Pm D2、GX-Pm D3、GX-Pm D4、NMG-Pm D5）。选取20种常见药物进行药敏实验,结果显示GX-Pm D1、GX-Pm D2、GX-Pm D3、GXPm D4未见耐药现象,而NMG-Pm D5表现出明显的新霉素及庆大霉素耐药现象。小鼠致病力实验结果表明荚膜血清A型菌株毒力强于荚膜血清D型菌株,通过攻毒后小鼠死亡数量时间及病理变化,成功筛选出了毒力较强的GX-Pm A及GX-Pm D4菌株。2.猪多杀性巴氏杆菌候选免疫原性蛋白OmpW、TbpA的克隆表达通过对ompW、tbpA基因及其表达产物进行生物信息学分析,证实了这两个基因的高度保守性,蛋白质理化性质分析结果表明OmpW属于疏水类蛋白质,TbpA蛋白属于亲水类蛋白质,并成功预测了两个蛋白的信号肽、跨膜区、抗原表位、二级结构及三级结构。基于此,成功构建了猪源多杀性巴氏杆菌OmpW、TbpA蛋白的重组表达载体p ET28a-ompW、p ET28a-tbpA、p SUMO-ompW、p SUMO-tbpA,通过筛选及条件优化成功得到了可溶性表达的OmpW蛋白,为猪多杀性巴氏杆菌新型疫苗研制奠定基础。

关键词：猪多杀性巴氏杆菌分离鉴定原核表达 OmpW TbpA

猪多杀性巴氏杆菌PlpB与Fur基因融合表达及免疫效果评价

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猪多杀性巴氏杆菌PlpB与Fur基因融合表达及免疫效果评价

作者：蒋惠婷黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)可引起猪传染性萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis，AR)、猪肺疫和猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratorydisease complex，PRDC)。由于多杀性巴氏杆菌无宿主特异性，可通过呼吸道进行传播，... 详细信息

猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)可引起猪传染性萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis，AR)、猪肺疫和猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratorydisease complex，PRDC)。由于多杀性巴氏杆菌无宿主特异性，可通过呼吸道进行传播，因此在世界各地广泛存在。随着我国养猪业的快速发展，多杀性巴氏杆菌病的危害性日益凸显，给养猪业造成了巨大经济损失。预防和控制多杀性巴氏杆菌病的最好方法是疫苗免疫，目前防治多杀性巴氏杆菌病的疫苗主要有灭活苗、弱毒苗和亚单位苗，这些疫苗对巴氏杆菌病的防制起到了一定作用，但由于多杀性巴氏杆菌血清型较多和免疫机制尚不明确，导致至今国内外仍缺乏理想的疫苗。 PlpB蛋白为多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白，研究表明在禽多杀性巴氏杆菌病中PlpB表现出良好的交叉保护性。Fur蛋白做为铁摄取调节蛋白，在细菌的生长中起到重要的作用，有研究表明Fur蛋白可抑制生物膜的形成从而达到抑菌的效果，并且可影响相关外膜蛋白的表达。本研究以临床分离鉴定的猪多杀性巴氏杆菌为研究对象，构建了PlpB、Fur及PlpB和Fur串联大肠杆菌重组质粒。利用生物信息学方法结合网络数据库对PlpB与Fur测序结果进行序列分析，预测PlpB、Fur蛋白理化与结构特性。结果表明分离到的多杀性巴氏杆菌为血清型B型的强毒株，对环丙沙星具有高度敏感性。PlpB基因是全长771bp，编码257个氨基酸残基的脂蛋白，其空间结构与创伤弧菌(Vibrio Vulnificus)的3K2D蛋白相似性较高，以此为模板成功构建了可靠的三维结构分子模型。Fur基因是全长432bp，编码144个氨基酸，其空间结构与铁吸收调节蛋白2w57.1.A相似性较高，以此为模板成功构建了可靠的三维结构分子模型。对PlpB与Fur蛋白抗原决定簇进行预测表明这两个蛋白作为抗原表位可能性较大，并且PlpB与Fur蛋白均无跨膜区与信号肽，是相对成熟稳定的蛋白。将构建的三个重组质粒转化到BL21中，诱导表达后可得到56ku的可溶性蛋白GST-PlpB、44ku的包涵体蛋白GST-Fur以及73ku表现为可溶性蛋白也可表现为不溶性的包涵体颗粒融合蛋白GST-PlpB-Fur。Western blotting印迹检测重组蛋白GST-PlpB、GST-Fur与融合蛋白GST-PlpB-Fur表明这三种蛋白都具有良好的反应原性。将三种蛋白用弗氏佐剂乳化后与全菌灭活疫苗、生理盐水分别免疫小鼠。免疫后用ELISA方法检测血清中IgG、IFN-γ和IL-4含量，并通过攻毒试验评价三个亚单位疫苗与一个全菌灭活苗的免疫效力。结果表明全菌灭活苗免疫效果最优，与其它三个亚单位疫苗差异均极显著，GST-PlpB-Fur融合蛋白苗免疫效果优于GST-PlpB与GST-Fur重组蛋白苗，Fur与PlpB蛋白在免疫效果上起到协同作用。本研究为今后开展猪多杀性巴氏杆菌亚单位疫苗的开发，毒力因子交叉保护性能的研究以及铁调节基因在细胞中的作用等研究奠定了基础。

关键词：猪多杀性巴氏杆菌 PlpB Fur 生物信息学免疫效果

我国中东部主要养猪地区死亡育肥猪呼吸道病原菌的流行病学调查及猪多杀性巴氏杆菌的特性鉴定

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中国农业科学 2024年第11期57卷 2254-2264页

作者：罗素贤周红蔺辉星范红结南京农业大学动物医学院

【目的】从我国中东部主要养猪地区因呼吸道疾病死亡的育肥猪病料中分离主要病原菌，并进行鉴定和分型，为近年流行的猪呼吸道病原菌的防控治疗提供流行病学依据。此外，对分离的猪多杀性巴氏杆菌（Pm）特性进行鉴定，为Pm疫苗研制提供... 详细信息

【目的】从我国中东部主要养猪地区因呼吸道疾病死亡的育肥猪病料中分离主要病原菌，并进行鉴定和分型，为近年流行的猪呼吸道病原菌的防控治疗提供流行病学依据。此外，对分离的猪多杀性巴氏杆菌（Pm）特性进行鉴定，为Pm疫苗研制提供参考。【方法】收集2021-2023年我国中东部主要养猪地区规模化猪场因呼吸道疾病死亡的育肥猪的病猪肺脏；用血琼脂和TSA培养基分离病原菌，通过微生物学和分子生物学方法鉴定分离菌株；合成adk、est、gdh、mdh、pgi、pmi和zwf基因引物，以分离的Pm为模板进行PCR，通过测序7对管家基因对Pm进行MLST分型；通过PCR对Pm进行荚膜分型和脂多糖分型；通过PCR对Pm的毒力因子进行检测；在ICR小鼠对单一分离的A型和部分D、F型Pm进行毒力鉴定；检测JS-65、JS-51和JS-34在ICR小鼠的LD50。【结果】共分离Pm 73株，分离率为15.53%；分离猪链球菌（SS）71株、猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）29株和副猪格拉菌（GPS）10株，分离率分别为15.11%、6.17%和2.13%。分型结果表明，Pm主要为A:L3型，占55%;SS主要为9型，占38.03%;APP主要为15型，占51.72%;GPS主要为5/12型，占60%。混合感染包括Pm+SS,Pm+APP,SS+APP和Pm+APP+GPS，混合感染占总猪群的16.67%。共分离到3种Pm荚膜型：A（67%）、D（30%）和F（3%）型；2种脂多糖型：L3型（56%）和L6型（44%）;9种ST分型：ST79、ST50、ST7、ST74、ST13、ST27、ST9、ST287和ST370，所占比例分别为33%、26%、16%、10%、4%、4%、3%、3%和1%。毒力基因检测结果表明：ptfA、fimA、hsf-2、exbB、exbD、tonB、fur、nanH、sodA和sodC的阳性率大于95%;hsf-1、pfhA、tadD、hgbA、hgbB、pmHAS、ompA、ompH、oma87和plpB阳性率在40%-90%之间；tbpA和nanB阳性率在10%-30%；未检出toxA。毒力鉴定结果表明A型菌株在剂量小于102 CFU时导致小鼠全部死亡，D型菌株在103 CFU剂量时小鼠死亡率为60%-100%,F型菌株在5×10～3 CFU剂量时小鼠死亡率为60%。在ICR小鼠检测JS-65、JS-51和JS-34的LD50，结果表明JS-65 LD50猪地区病原菌分离结果表明，Pm、SS、APP和GPS是死亡育肥猪的主要呼吸道病原菌，Pm在肺脏中的分离率最高。采用RIRDC分型鉴定到一株ST370 Pm，拓展了猪Pm的MLST分型数据。Pm优势基因型为A:L3:ST79，其在ICR小鼠中毒力最强，最小致死量小于10 CFU，为后续Pm灭活疫苗研制奠定基础。

关键词：流行病学猪多杀性巴氏杆菌鉴定分子分型