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美蠊小肽抗氧化应激诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡的机制研究

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美蠊小肽抗氧化应激诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡的机制研究

作者：孔彩华大理大学

学位级别：硕士

目的在实际养猪生产中,集约化规模化饲养、高温、高海拔等环境因素是引起母猪氧化应激的主要因素。氧化应激可诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡,导致卵泡异常闭锁,降低可用卵泡的数目,从而降低母猪的繁殖性能。美洲大蠊小肽(美蠊小肽)分离于美洲... 详细信息

目的在实际养猪生产中,集约化规模化饲养、高温、高海拔等环境因素是引起母猪氧化应激的主要因素。氧化应激可诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡,导致卵泡异常闭锁,降低可用卵泡的数目,从而降低母猪的繁殖性能。美洲大蠊小肽(美蠊小肽)分离于美洲大蠊虫体,具有较强的体内外抗氧化活性。本文的研究目的是探讨美蠊小肽对HO诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用及其抗凋亡的具体信号通路,为提高母猪的产仔数、提升其繁殖效率奠定理论基础,为美蠊小肽在畜牧生态养殖上的开发应用提供新的思路。方法采集和培养猪卵巢颗粒细胞,不同浓度的HO处理颗粒细胞不同时间,使用CCK-8法及流式细胞术检测细胞活力和凋亡率以确定建立细胞氧化应激模型的HO最适浓度及时间;不同浓度的美蠊小肽处理氧化应激颗粒细胞不同时间,CCK-8法检测细胞活力,测定丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量、活性氧(ROS)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性以确定美蠊小肽的最适修复浓度及时间;使用q RT-PCR、TUNEL法、蛋白免疫印迹和Fox O1质粒转染分析美蠊小肽对氧化应激猪卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用及其关键调控因子;最后使用蛋白免疫印迹、免疫共沉淀法、免疫荧光和细胞凋亡检测等分析美蠊小肽抵抗HO诱导猪颗粒细胞凋亡的信号通路。结果(1)100μmol/L HO处理6 h可显著降低卵巢颗粒细胞活力和诱导其发生凋亡,细胞凋亡率为32.95%(P细胞活力,显著降低HO诱导的氧化应激猪颗粒细胞中MDA和NO含量、ROS的水平,增加SOD的活性,下调凋亡相关基因Caspase-3、Bax和Fas L的m RNA水平,抑制HO诱导的猪颗粒细胞凋亡,且对细胞无损害作用(P猪卵巢颗粒细胞中Fox O1的抑制效果最明显,可显著升高氧化应激猪卵巢颗粒细胞中p-Fox O1/Fox O1比值,降低Caspase-3的蛋白表达,过表达Fox O1后,美蠊小肽的作用效果相同(P猪卵巢颗粒细胞中Fox O1与14-3-3蛋白的结合、增加Fox O1转位至细胞质并降低Fox O1的乙酰化水平(P颗粒细胞中p-JNK/JNK比值,增加p-Fox O1/Fox O1比值,从而降低Caspase-3表达量,减少细胞凋亡(P猪卵巢颗粒细胞凋亡有明显的抑制作用,主要通过调控Fox O1与14-3-3蛋白的相互作用以及JNK/Fox O1信号通路影响Fox O1的核质易位来抵抗氧化应激诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡,Fox O1的乙酰化修饰也参与其调控作用。

关键词：美蠊小肽氧化应激猪卵巢颗粒细胞 FoxO1 细胞凋亡分子机制

野黄芩苷抗ZEA致猪卵巢颗粒细胞损伤及作用机制的研究

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野黄芩苷抗ZEA致猪卵巢颗粒细胞损伤及作用机制的研究

作者：张新越山西农业大学

学位级别：硕士

目的:探究野黄芩苷（scutellarin,Scu）抗玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）致猪卵巢颗粒细胞损伤及其作用机制。方法:用机械法分离培养猪卵巢颗粒细胞,经间接免疫荧光染色卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone receptor,FSHR... 详细信息

目的:探究野黄芩苷（scutellarin,Scu）抗玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）致猪卵巢颗粒细胞损伤及其作用机制。方法:用机械法分离培养猪卵巢颗粒细胞,经间接免疫荧光染色卵泡刺激素受体（follicle-stimulating hormone receptor,FSHR）进行鉴定;MTT法检测野黄芩苷在猪卵巢颗粒细胞上的安全浓度和不同浓度ZEA对颗粒细胞存活率的影响;选取野黄芩苷2000、1000和500μg/m L分别与60μM的ZEA共处理颗粒细胞,同时设置细胞对照组和60μM ZEA处理组;培养24 h后,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞周期分布情况;分别采用q RT-PCR技术、Western Blot检测CDK1、CDK2、CDK4以及PCNA的m RNA和蛋白表达量;Western Blot检测Wnt5a、β-catenin、c-myc以及CCND1的表达量;Lipofectamine 2000转染si Wnt5a后,Western Blot检测CDK1、CDK2、CDK4和PCNA的蛋白表达量。结果:1.从猪卵巢中分离细胞,FSHR荧光染色显示出绿色荧光,表明成功分离猪卵巢颗粒细胞,可用于后续试验。2.在所设浓度范围内,野黄芩苷对猪卵巢颗粒细胞没有毒性。3.60μM ZEA作用颗粒细胞24 h,细胞存活率在50%左右,作为后续试验的损伤模型。4.与对照组相比,模型组G0/G1期细胞比例显著降低（P细胞比例显著增多（P细胞比例显著增多（P细胞比例显著减少（P猪卵巢颗粒细胞S期阻滞来发挥抗损伤作用。5.与对照组相比,模型组CDK1、CDK2、CDK4和PCNA的m RNA相对表达量显著减少（P细胞周期缓解ZEA诱导的猪卵巢颗粒细胞损伤。6.与对照组相比,模型组Wnt5a和c-myc的表达量显著降低（P0.05）;与模型组相比,野黄芩苷处理组Wnt5a、β-catenin、c-myc以及CCND1的表达量均显著增高（P卵巢颗粒细胞损伤。7.与si RNA-NC相比,si Wnt5a组PCNA、CDK1、CDK2和CDK4的表达量显著降低（P0.05）,si Wnt5a+ZEA+Scu2000μg/m L和si Wnt5a+ZEA+Scu1000μg/m L组CDK2的表达量显著升高（P细胞周期,促进细胞增殖来缓解ZEA诱导的猪卵巢颗粒细胞损伤。

关键词：野黄芩苷玉米赤霉烯酮猪卵巢颗粒细胞细胞周期 Wnt5a

海藻酸通过氧化应激途径对猪卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的作用机制

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海藻酸通过氧化应激途径对猪卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的作用机...

作者：李延坤西北农林科技大学

学位级别：硕士

提高母猪的繁殖性能对我国畜牧业的发展十分重要。卵泡是卵巢的基本功能单位,颗粒细胞是卵泡中最大的细胞群,在卵泡发育、成熟、凋亡和闭锁过程中起重要作用。海藻酸是一种从褐藻中提取的天然多糖,广泛应用于化学工业与食品工业等领域,... 详细信息

提高母猪的繁殖性能对我国畜牧业的发展十分重要。卵泡是卵巢的基本功能单位,颗粒细胞是卵泡中最大的细胞群,在卵泡发育、成熟、凋亡和闭锁过程中起重要作用。海藻酸是一种从褐藻中提取的天然多糖,广泛应用于化学工业与食品工业等领域,已有研究证明海藻酸有一定的抗炎、抗过敏、免疫调节等生物活性,但海藻酸对雌性生殖的影响鲜有报道。随着海藻酸越来越广泛地使用,其对家畜生殖发育的影响值得研究。本研究以猪卵巢颗粒细胞为研究对象,旨在探究海藻酸对细胞活力、类固醇激素合成的影响,并从氧化应激、凋亡与自噬等方面探究了其影响机制。本研究首先使用添加海藻酸的DMEM/F12培养液培养猪卵巢颗粒细胞,通过CCK8检测、ROS染色、ELISA、RT-q PCR和蛋白免疫印迹等方法,探究海藻酸对细胞活力及类固醇激素合成的影响;通过GSH荧光染色、GSH定量、ROS染色、TAOC检测、MDA检测、Annexin V/PI凋亡检测、JC-1线粒体染色和自噬泡染色等方法探究海藻酸对细胞氧化应激、凋亡及自噬的影响。最后,本研究以10 mg/Kg的剂量,连续35天向小鼠腹腔注射海藻酸溶液,进行活体验证。本研究得出以下结果:1.20μM及以上浓度的海藻酸显著抑制猪卵巢颗粒细胞活力。CCK8检测、ROS荧光染色和Caspase-3及P62蛋白的免疫印迹结果表明,当海藻酸浓度≥20μM时,其浓度越高,猪卵巢颗粒细胞的活力越低。2.20μM海藻酸抑制猪卵巢颗粒细胞类固醇激素合成。与对照组相比,猪卵巢颗粒细胞经20μM海藻酸处理24 h后,雌二醇(P细胞中类固醇激素合成关键蛋白CYP19A1(P猪卵巢颗粒细胞发生氧化应激。与对照组相比,猪卵巢颗粒细胞经20μM海藻酸处理24 h后,细胞中GSH水平显著下降(P猪卵巢颗粒细胞线粒体介导的细胞凋亡和自噬发生。与对照组相比,猪卵巢颗粒细胞经20μM海藻酸处理24 h后,Annexin V/PI凋亡检测结果表明凋亡细胞所占比例显著上升(P细胞线粒体膜电位显著下降(P卵巢类固醇激素的合成,小鼠卵巢氧化应激水平升高并发生凋亡。综上所述,20μM的海藻酸可以显著抑制猪卵巢颗粒细胞活力,促使细胞发生氧化应激,引发线粒体介导的凋亡和自噬,最终抑制细胞类固醇激素合成。

关键词：海藻酸猪卵巢颗粒细胞类固醇激素氧化应激凋亡

猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1基因表达调控机制

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猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1基因表达调控机制

作者：李琦琦南京农业大学

学位级别：硕士

我国是养猪大国,母猪繁殖力低下已成为制约我国养猪业生产发展的瓶颈之一。排卵数是决定母猪繁殖潜能的初始因素。研究发现排卵数较高的母猪表现出较少的卵泡闭锁,而雌二醇（E2）浓度低是猪卵泡闭锁的主要特征之一。E2对于维持猪生殖过... 详细信息

我国是养猪大国,母猪繁殖力低下已成为制约我国养猪业生产发展的瓶颈之一。排卵数是决定母猪繁殖潜能的初始因素。研究发现排卵数较高的母猪表现出较少的卵泡闭锁,而雌二醇（E2）浓度低是猪卵泡闭锁的主要特征之一。E2对于维持猪生殖过程是必需的,适量的E2能够促进卵巢颗粒细胞增殖,同时抑制颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。实验室前期研究发现E2合成通路关键限速酶P450arom编码基因CYP19A1在猪卵泡闭锁过程中表达下调,但其在猪卵泡闭锁中的作用和表达下调的机制尚不清楚。本文拟以猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1基因为研究对象,分析其在猪卵巢颗粒细胞凋亡和E2合成中的作用,以及转录因子SMAD4和miRNAs调控其表达的分子机制,以期为提高母猪繁殖力提供理论依据。全文的主要研究结果如下:（1）CYP19A1抑制猪卵巢顆粒细胞凋亡和促进E2合成利用RNA干扰技术（RNAi）和过表达技术敲低和过表达猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1,分析其对猪卵巢颗粒细胞凋亡和E2合成的影响。结果显示:CYP19A1特异性siRNA可有效敲低猪卵巢颗粒细胞内源性CYP19A1水平,卵巢颗粒细胞的凋亡水平显著上调,而卵巢颗粒细胞培养液中E2浓度显著下调;构建的猪CYP19A1基因真核表达载体可在猪卵巢颗粒细胞中高效表达,过表达CYP19A1可显著抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡水平,上调颗粒细胞培养液中E2含量。上述研究结果证实CYP19A1是猪卵巢颗粒细胞中的抗凋亡因子,也是猪卵巢颗粒细胞中E2合成必需的。（2）SMAD4作为转录因子直接调控猪卵粟颗粒细胞中CYP19A1表达利用双荧光素酶基因报告系统鉴定出猪CYP19A1基因印卵巢特异性核心启动子区（-785/-681 nt）,发现2个典型的SMAD4结合位点（SBE）。荧光素酶活性分析发现SMAD4可上调猪卵巢颗粒细胞CYP19A1基因启动子区活性,染色质免疫共沉淀（ChIP）试验证实SMAD4可与猪CYP19A1基因启动子区上SBE位点直接结合。流式细胞计数法（FACS）发现SMAD4可通过CYP19A1抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡。放射免疫试验（RIA）显示SMAD4可通过CYP19A1促进猪卵巢颗粒细胞E2合成。上述研究结果充分表明SMAD4能够作为转录因子直接与猪CYP19A1基因启动子区结合,促进CYP19A1基因的转录,上调猪卵巢颗粒细胞中E2合成,从而抑制猪卵巢颗粒细胞凋亡。（3）SMAD4通过miR-126*/FSHR轴调控猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1表达利用生物信息学方法与分子生物学技术证实猪FSHR基因是猪卵巢颗粒细胞中miR-126’*的功能靶基因,miR-126*靶向抑制猪卵巢颗粒细胞中FSHR基因的表达,促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。序列分析发现猪miR-126*的启动子区上含有SBE位点,荧光素酶活性试验证实SMAD4作为转录因子可与miR-126*的启动子区上SBE位点结合,抑制猪卵巢颗粒细胞中内源性miR-126*的表达,上调猪卵巢颗粒细胞中FSHR基因的表达。随后设计共转试验通过QRT-PCR与western blot技术发现SMAD4通过miR-126**/FSHR轴促进卵巢颗粒细胞中CYP19A1的表达。以上结果证实在猪卵巢颗粒细胞中SMAD4作为转录因子通过靶向miR-126*/FSHR轴间接调控CYP19A1基因转录。（4）miRNAs在转录后水平调控猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1表达结合生物信息学分析与卵泡闭锁过程中差异表达miRNA芯片结果发现miR-10b与miR-146b-5p是猪CYP19A1基因潜在的调控miRNAs。在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中,利用荧光素酶活性试验、QRT-PCR与western blot等技术发现miR-10b与miR-146b-5p均可通过靶向结合CYP19A1基因3’-UTR并抑制其表达。FACS证实miR-10b与miR-146b-5p是猪卵巢颗粒细胞中的促凋亡因子,通过靶向抑制CYP19A1上调猪卵巢颗粒细胞的凋亡水平。放射免疫试验显示过表达miR-10b可通过CYP19A1显著抑制猪卵巢颗粒细胞中E2合成。上述结果充分说明miRNAs（miR-10b与miR-146b-5p）能在转录后水平调控猪卵巢颗粒细胞中CYP19A1的表达与功能。综上所述,本文证实CYP19A1是维持猪卵巢颗粒细胞状态与E2分泌必需的。在猪卵巢颗粒细胞中,转录因子、表观遗传因子和调控轴（SMAD4、miR-10b、miR-146b-5p与miR-126*-FSHR轴）可通过直接与间接途径在转录水平与转录后水平调控CYP19A1的表达。研究结果为揭示CYP19A1基因在猪卵巢颗粒细胞中的功能与表达调控机制,解析猪卵泡发育与闭锁的调控网络提供理论依据。

关键词：猪卵巢颗粒细胞 CYP19A1 SMAD4 miRNAs E2合成

MAPK信号通路介导养精种玉汤有效部位调节猪卵巢颗粒细胞雄激素水平的作用机制

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中国中西医结合杂志 2015年第7期35卷 847-853页

作者：叶丹凤马红霞吴婉婷赖毛华刘华郑艳华马婉莹广州医科大学研究生院广州510120 广州医科大学附属第一医院中医科广州510120 广州医科大学中西医结合研究所广州510120

目的通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路探讨养精种玉汤正丁醇(ZDC)及乙酸乙酯(YSYZ)提取物降低猪卵巢颗粒细胞雄激素水平的作用机制。方法分离并培养猪卵巢颗粒细胞,将细胞按不同浓度的MAPK抑制剂... 详细信息

目的通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路探讨养精种玉汤正丁醇(ZDC)及乙酸乙酯(YSYZ)提取物降低猪卵巢颗粒细胞雄激素水平的作用机制。方法分离并培养猪卵巢颗粒细胞,将细胞按不同浓度的MAPK抑制剂PD98059孵育,分为0(空白对照)、1、3、10、25μmol/L共5组,培养24 h后,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测17α-羟化酶/C17,20-裂解酶(cytochrome P450c17a,CYP17)mRNA表达水平,应用放射免疫测定法(RIA)检测细胞上清液雄激素(睾酮)含量,筛选最佳的PD98059作用浓度;采用10μmol/L PD98059干预卵巢颗粒细胞24 h后,将细胞培养液更换成含或不含有不同浓度(0、1、5、25、50 mg/m L)的养精种玉汤有效成分提取物ZDC及YSYZ干预不同的时间(3、6、18、24 h)后,采用Western blot法检测各组磷酸化的细胞外信号调节激酶(p-ERK1/2)、c-Fos及CYP17蛋白表达水平,RIA法检测细胞上清液睾酮含量。结果 10μmol/L PD98059可明显降低猪卵巢颗粒细胞p-ERK1/2蛋白表达,增加CYP17 mRNA表达,并可增加细胞上清液睾酮含量(P猪卵巢颗粒细胞p-ERK1/2、c-Fos蛋白水平并降低CYP17蛋白的表达,降低细胞上清液睾酮含量(P猪卵巢颗粒细胞的雄激素生成。

关键词：养精种玉汤雄激素猪卵巢颗粒细胞丝裂原活化蛋白激酶

过氧化氢诱导猪卵巢颗粒细胞自噬及其对凋亡的影响

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南京农业大学学报 2016年第5期39卷 814-818页

作者：李烈川申明宁彩波管志强蒋毅吴望军刘红林南京农业大学动物科技学院江苏南京210095

[目的]本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。[方法]采用流式细胞术和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)检测不同浓度(0、50、100和150μmol·L^(-1))过氧化氢处理12 h对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用... 详细信息

[目的]本试验旨在研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。[方法]采用流式细胞术和细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK8)检测不同浓度(0、50、100和150μmol·L^(-1))过氧化氢处理12 h对猪颗粒细胞的凋亡诱导作用和细胞活力的影响;Western-blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3,包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)和自噬相关蛋白P62/SQSTM1的表达量变化,转染GFP-LC3质粒检测自噬体的数量;利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)提前4 h抑制自噬后再氧化应激12 h,用流式细胞术检测细胞的凋亡率,CCK8检测细胞活力。[结果]氧化应激12 h后,细胞活力随过氧化氢浓度提高显著降低,凋亡率显著上升。在氧化应激前6 h LC3-Ⅱ相对表达量先增加后减少,P62的相对表达量先减少再增加;转染GFP-LC3质粒后,自噬体数量极显著上调,6 h后显著下降,上述结果表明在氧化应激早期自噬增加,持续氧化应激自噬受到抑制。若提前4 h用3-MA抑制自噬,再用过氧化氢处理12 h,抑制自噬后细胞凋亡率较单独氧化应激组显著下降,细胞活力也显著上升。[结论]氧化应激能诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡和早期自噬,若抑制早期自噬,凋亡率会下降。

关键词：氧化应激自噬凋亡猪卵巢颗粒细胞 3-MA

重组质粒pGMLV-SC1 RNAi的构建及其对猪卵巢颗粒细胞c-Fos的影响

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广东医学 2014年第3期35卷 336-339页

作者：叶丹凤郑艳华丁涛薛士鹏马红霞广州医科大学研究生院广州医科大学附属第四医院中医科广州511447 湖北省荆门市第二人民医院妇产科 448000 南阳医学高等专科学校科研处河南南阳473061 广州医科大学附属第一医院中医科广州510120

目的构建慢病毒载体及观察其介导的RNA干扰猪卵巢颗粒细胞c-Fos基因表达情况。方法通过在线软件设计猪c-Fos基因shRNA序列,合成、退火形成双寡链核酸后克隆到PGMLV-SC1载体,测序。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞,包装... 详细信息

目的构建慢病毒载体及观察其介导的RNA干扰猪卵巢颗粒细胞c-Fos基因表达情况。方法通过在线软件设计猪c-Fos基因shRNA序列,合成、退火形成双寡链核酸后克隆到PGMLV-SC1载体,测序。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞,包装成4组病毒(shRNA c-Fos1、shRNA c-Fos2、shRNA c-Fos3、shRNA c-Fos4),并测定滴度。感染猪卵巢颗粒细胞,采用PCR和Western blot检测各组细胞c-Fos mRNA和蛋白表达。结果重组克隆中插入片段序列与设计的Oligo序列完全一致。滴度为1×108TU/mL,感染复数30时,阴性对照组、实验shRNA c-Fos4、shRNA c-Fos3、shRNA c-Fos2、shRNA c-Fos1组c-Fos mRNA的表达分别为对照组的0.842 7±0.065 6、0.797 6±0.073 8、0.694 1±0.048 9、0.653 7±0.047 0、0.312 3±0.010 6倍(P猪卵巢颗粒细胞c-Fos基因慢病毒RNAi表达载体并筛选出最佳siRNA序列。为c-Fos基因的功能研究提供了研究基础。

关键词： RNA干扰慢病毒猪卵巢颗粒细胞

RNAi抑制Smad4基因表达对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响

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RNAi抑制Smad4基因表达对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响

作者：张海燕南京农业大学

学位级别：硕士

Smads蛋白家族是近年新发现的细胞内信号传导蛋白,在转化生长因子（transforming growth factor, TGF-β）超家族成员的信号转导通路中具有重要的作用。Smad4作为Smad蛋白家族重要成员之一,是哺乳类中发现的唯一一种Co-Smad,被认为是TG... 详细信息

Smads蛋白家族是近年新发现的细胞内信号传导蛋白,在转化生长因子（transforming growth factor, TGF-β）超家族成员的信号转导通路中具有重要的作用。Smad4作为Smad蛋白家族重要成员之一,是哺乳类中发现的唯一一种Co-Smad,被认为是TGF-p各成员信号传递必需的中心转导分子。Smad4在TGF-β/Smad信号通路中发挥着关键作用,其表达缺失或者突变都会引起TGF-β/Smad信号转导紊乱,从而对机体组织或细胞产生重要影响。近年来研究发现小鼠卵巢中存在Smad4信号转导途径,TGF-β对卵泡的分化调节很有可能是通过Smad4信号途径实现。本文利用RNAi技术沉默Smad4基因,探讨其对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响。设计并合成靶向Smad4（?）勺小分子干扰RNA,在脂质体的介导下转染猪卵巢颗粒细胞,荧光定量PCR检测Smad4mRNA表达情况;MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法分析检测细胞活性;原位末端核苷酸标记法（TUNEL）及Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况;荧光定量PCR检测Bcl-2,Bax的mRNA表达水平。 1Smad4-siRNA转染猪卵巢颗粒细胞及其效率检测根据猪Smad4基因序列设计小分子RNA,利用脂质体转染猪卵巢颗粒细胞。荧光定量PCR检测Smad4mRNA表达水平, Smad4-siRNA转染浓度为8pmoL,作用36h时,Smad4-siRNA抑制效果最好,siRNA实验组较空白对照组下降84%（p＜0.01）。利用MTT比色法检测干扰后颗粒细胞活性,结果显示,siRNA实验组细胞活性（0.27）显著低于对照组（0.31）（p＜0.05）,说明Smad4-siRNA转染对卵巢颗粒细胞的增殖有明显的抑制作用,推测RNAi抑制Smad4基因表达可能引起猪卵巢颗粒细胞凋亡。 2RNAi抑制Smad4表达对颗粒细胞凋亡的影响采用原位末端核苷酸标记法（TUNEL）和Annexin V/PI流式细胞仪进行细胞凋亡情况分析。结果显示,siRNA实验组较对照组凋亡细胞明显增多,Smad4基因表达被抑制后,细胞凋亡率（22.1%）显著高于对照组（17.0%）（p＜0.05）。表明沉默Smad4基因可促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。 3RNAi抑制Smad4表达对Bcl-2和Bax的影响采用荧光定量PCR法检测凋亡相关基因Bcl-2以及Bax在颗粒细胞中相对表达水平。结果显示,与空白组相比,siRNA实验组Bcl-2表达显著下调,降低79%（p＜0.01）。结果进一步表明沉默Smad4基因可促进猪卵巢颗粒细胞凋亡,其机制可能与调控Bcl-2表达有关。

关键词：猪卵巢颗粒细胞 Smad4 RNA干扰细胞凋亡

短链脂肪酸对猪卵巢颗粒细胞性激素合成cAMP-PKA信号通路的影响

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短链脂肪酸对猪卵巢颗粒细胞性激素合成cAMP-PKA信号通路的影响

作者：李梦娇南京农业大学

学位级别：硕士

本研究旨在探究短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)调节猪卵巢颗粒细胞(Porcine granulosa cells,PGCs)性激素分泌的cAMP-PKA信号通路。试验分别采用不同浓度梯度(0、0.005、0.05、0.5、5、10mM)的乙酸、丙酸、丁酸,以及PKA激动剂Forskolin和cAMP的抑制剂Bupivacaine处理PGCs,分析 SCFAs 对 PGCs 的 G 蛋白偶联受体 41(G protein coupled receptors 41,GPR41)和 GPR43、cAMP、孕酮(Progesterone,P4)、雌二醇(Estradiol,E2)及类固醇激素合成相关功能基因表达的影响。1 SCFAs对PGCs性激素合成的影响0.005～20 mM乙酸、0.005～0.05 mM丙酸对PGCs的P4分泌无显著影响。但0.05 mM 丁酸显著促进PGCs的P4分泌(P细胞内cAMP的含量(P<0.05),5 mM乙酸、丙酸、丁酸分别显著下调PGCs的cAMP含量(P<0.05),5mM乙酸、丙酸、丁酸分别与10μM Forskolin共处理不影响Forskolin对cAMP含量的上调作用。2.3 μM Bupivacaine 显著下调 PGCs 内 cAMP 含量(P<0.05),2.3 μM Bupivacaine分别与5 mM乙酸、丙酸、丁酸的共处理组PGCs内cAMP含量均显著低于2.3pM Bupivacaine处理组和5 mM乙酸、丙酸、丁酸处理组(P<0.05)。3 SCFAs对PGCs类固醇激素合成功能基因表达的影响10 μM Forskolin显著下调PGCs的ER-β mRNA表达(P<0.05),显著上调SF-1、StAR、3β-HSD、P450scc mRNA 表达量(P<0.05)。2.3μM Bupivacaine显著上调ER-β mRNA的表达(P<0.05)、下调StAR、P450scc mRNA表达(P<0.05)。5 mM乙酸显著上调StAR mRNA的表达(P<0.05),显著下调ER

关键词：短链脂肪酸猪卵巢颗粒细胞孕酮雌二醇 GPRs-cAMP-PKA信号通路