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Influence of chitosan nanofiber scaffold on porcine endogenous retroviral expression and infectivity in pig hepatocytes

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World Journal of Gastroenterology 2011年第22期17卷 2774-2780页

作者： Bing Han Xiao-Lei Shi Jiang-Qiang Xiao Yue Zhang Xue-Hui Chu Jin-Yang Gu Jia-Jun Tan Zhong-Ze Gu Yi-Tao Ding Department of Hepatobiliary Surgery the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical SchoolNanjing 210008Jiangsu ProvinceChina Department of Hepatobiliary Surgery Drum Tower Clinical Medical College of Nanjing Medical UniversityNanjing 210008Jiangsu ProvinceChina State Key Laboratory of Bioelectronics Southeast UniversityNanjing 210000Jiangsu ProvinceChina

AIM: To investigate the influence of chitosan nanofiber scaffold on the production and infectivity of porcine endogenous retrovirus (PERV) expressed by porcine hepatocytes. METHODS: Freshly isolated porcine hepatocytes were cultured with or without chitosan nanofiber scaffold (defined as Nano group and Hep group) for 7 d. The daily collection of culture medium was used to detect reverse transcriptase (RT) activity with RT activity assaykits and PERV RNA by reverse transcription-polymerase chain reaction (PCR) and real time PCR with the PERV specific primers. And Western blotting was performed with the lysates of daily retrieved cells to determine the PERV protein gag p30. Besides, the in-vitro infectivity of the supernatant was tested by incubating the human embryo kidney 293 (HEK293) cells. RESULTS: The similar changing trends between two groups were observed in real time PCR, RT activity assay and Western blotting. Two peaks of PERV expression at 10H and Day 2 were found and followed by a regular decline. No significant difference was found between two groups except the significantly high level of PERV RNA at Day 6 and PERV protein at Day 5 in Nano group than that in Hep group. And in the in-vitro infection experiment, no HEK293 cell was infected by the supernatant. CONCLUSION: Chitosan nanofiber scaffold might prolong the PERV secreting time in pig hepatocytes but would not obviously influence its productive amount and infectivity, so it could be applied in the bioartificial liver without the increased risk of the virus transmission.

关键词：猪内源性逆转录病毒纳米纤维肝细胞壳聚糖感染性 Western印迹法支架 HEK293细胞

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广西巴马小型猪PERV全基因扩增与分析及cDNA克隆的构建

广西巴马小型猪PERV全基因扩增与分析及cDNA克隆的构建

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作者：钟雅婷广西大学

学位级别：硕士

使用猪源器官进行异种移植被认为是解决当前人源供体器官短缺,治疗终末期器官疾病的有效方法之一。而广西巴马小型猪是采用闭锁纯繁近交方式选育的广西地方特有的小型猪品种,是一种遗传稳定,性状优良的实验动物,可作为异种移植的理想器... 详细信息

使用猪源器官进行异种移植被认为是解决当前人源供体器官短缺,治疗终末期器官疾病的有效方法之一。而广西巴马小型猪是采用闭锁纯繁近交方式选育的广西地方特有的小型猪品种,是一种遗传稳定,性状优良的实验动物,可作为异种移植的理想器官供体。但是,由于广西巴马小型猪体内普遍存在猪内源性逆转录病毒(Porcine endogenous retrovirus, PERV),能够以前病毒DNA形式整合进宿主细胞基因组中,并随细胞染色体复制而复制。PERV在体外可以感染多种人源细胞的发现,引起了人们对异种移植安全性的广泛关注。因此,有必要开展广西巴马小型猪PERV的基础研究,了解其感染机制,以评估PERV的病原安全性。本研究采用PCR技术,扩增获得4条覆盖广西巴马小型猪PERV全基因的重叠片段,经拼接获得1条完整的广西巴马小型猪PERV (PERV-BM)全基因序列,大小为8774bp。遗传进化分析表明PERV-BM属于PERV A亚型;序列分析发现,PERV-BM的5'UTR的启动子和增强子区域分别位于400-467bp与313-432bp位置;对推导氨基酸序列分析则发现病毒的env蛋白中含有15个可能的抗原表位,其跨膜区位于600-622aa位置,含有Ser、 Thr和Tyr磷酸化位点的数量分别为20、7和9个,并含有10个可能的糖基化位点。利用分子钟假说对PERV-BM的3'LTR及本实验扩增的另外8条PERV-BM的3'LTRs进行分析,结果表明PERV-BM大约进化于7.1×106年前。在完成全基因测序的基础上,本研究进一步构建了PERV-BM全基因cDNA克隆。将4个覆盖全基因组的重叠基因片段通过pMD18-T中间载体依次连接并克隆到pBluescript Ⅱ SK (-)载体上,构建cDNA克隆。将该cDNA克隆与GenBank登录所有PERV全序列进行比对分析,发现存在15个保守碱基的突变。为消除这些突变位点在下一步病毒拯救中造成的潜在影响,通过定点突变和化学合成的方法成功恢复15个突变碱基。将突变后的PERV-BM全长序列上传GenBank,登录号为HM159246。同时为便于鉴定,本研究还在所构建cDNA克隆上引入突变,将BM-PERV全长cDNA克隆第8408位碱基由A突变为C,引入新的单一酶切位点Aat Ⅱ,获得了cDNA克隆的突变株。经Not Ⅰ/Nhe Ⅰ、Nhe Ⅰ/Cal Ⅰ、Not Ⅰ/Cal Ⅰ酶切及全长测序鉴定,证实所构建的cDNA克隆为PERV-BM全基因的cDNA克隆,命名为pBluescript Ⅱ SK-PERV-BM。接着通过反向遗传的方法构建了PERV-BM感染性cDNA克隆并对其进行了初步鉴定,为从DNA水平上探索PERV的感染机制以及感染人源细胞后的复制、转录等过程打下坚实基础。

关键词：广西巴马小型猪猪内源性逆转录病毒全基因组扩增基因分析cDNA克隆

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长白与青海八眉“二元杂交”猪种群PERV亚型分析

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中国人兽共患病学报 2007年第9期23卷 878-882页

作者：邢晓为许生成莫朝晖宁鹏王勇王维中南大学湘雅三医院细胞移植与基因治疗中心长沙410013 青海大学农牧学院

目的研究长白与青海八眉"二元杂交"猪种群携带的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)亚型,为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据。方法从长白与青海八眉"二元杂交"猪种群中随机采集33头个体外周血,应用PCR和RT... 详细信息

目的研究长白与青海八眉"二元杂交"猪种群携带的内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)亚型,为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据。方法从长白与青海八眉"二元杂交"猪种群中随机采集33头个体外周血,应用PCR和RT-PCR技术分别检测PERV前病毒DNA和mRNA,研究该种群携带PERV的亚型,并对PCR扩增的灵敏性进行评估。克隆测序该猪种PERVenv基因,结果用NCBI中的BLAST软件进行分析。结果所检测的33头个体均带有PERV前病毒DNA,外周血中均有PERV mRNA表达,其中,69.7%(23/33)个体携带env-A,env-B和env-C三种囊膜蛋白基因,而其余的30.3%(10/33)个体只带有env-A和env-B两种囊膜蛋白基因,env-C基因缺失。灵敏性分析实验结果表明,PCR扩增PERV时,DNA模板不能少于15ng。克隆env-A,env-B和env-C基因,结果提交GenBank(GenBank登录号分别为DQ856326、DQ856327、DQ856328)。生物信息分析结果表明,该猪种env基因与GenBank登录其他猪种序列相比存在差异,其中env-A、env-B基因发生移码突变,蛋白合成提前终止。结论长白与青海八眉"二元杂交"猪种群携带PERV,69.7%个体为PERV-ABC亚型;缺失突变使PERVenv-A,env-B基因阅读框发生改变,有可能影响其感染特性,从生物安全性方面综合考虑,该猪种不宜作为异种移植供体。

关键词：猪内源性逆转录病毒亚型异种移植克隆

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PERV检测方法的建立及其在猪肝细胞型生物人工肝中安全性的初步研究

PERV检测方法的建立及其在猪肝细胞型生物人工肝中安全性的初步研...

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作者：郭海涛第三军医大学

学位级别：硕士

急性肝衰竭、暴发性肝衰竭和终末期慢性肝病目前的死亡率仍较高，其最有效的疗法是肝移植，但因供肝来源匮乏，很多患者在等待时死亡。故对这类疾病的生物治疗以起到过渡支持作用，如：生物人工肝等，逐渐成为研究热点之一。采用猪或转... 详细信息

急性肝衰竭、暴发性肝衰竭和终末期慢性肝病目前的死亡率仍较高，其最有效的疗法是肝移植，但因供肝来源匮乏，很多患者在等待时死亡。故对这类疾病的生物治疗以起到过渡支持作用，如：生物人工肝等，逐渐成为研究热点之一。采用猪或转基因猪肝细胞已成为生物人工肝的主要细胞来源，但自报道猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus，PERV)感染体外培养人细胞以来，跨种族间感染越来越引起人们的重视。 PERV是一类C型逆转录病毒，在形态学和生化学上具有其它哺乳动物C型病毒的典型特征，病毒cDNA已整合于猪基因组，其mRNA在组织中亦呈现高表达。根据PERV囊膜env基因受体结合区的差异，可将其分为3种不同的类型：PERV-A、PERV-B和PERV-C。自Patience等首先发现PERV能够感染体外培养人胚肾293细胞系，已有研究证实PERV可感染人细胞系，如人T淋巴细胞系C8166、脾细胞系WIL2.NS.6TG、单核细胞系THP-1以及灵长目PBMC。从感染PERV的人细胞中分离出的病毒粒子其感染范围更加广泛,包括人二倍体纤维瘤细胞和T、B淋巴细胞系均可感染。此外，在有丝分裂原刺激下体外培养猪外周血单个核细胞(PBMC)、动脉内皮细胞、PK-15细胞等均可观察到病毒颗粒的释放。目前已建立了PERV感染的动物模型，但有关接受活猪组织或细胞移植的临床病例的报道均未发现PERV感染的确切证据，其在生物人工肝中安全性的问题亦需进一步研究。本课题在体外两步法分离猪肝细胞的基础上，观察了中国实验小型猪PERV携带情况，对血清中病毒释放情况进行了检测，并以此初步建立了PERV的检测方法;在了解猪肝细胞不同培养方式下(普通培养、混合凝胶及生物反应器培养)细胞形态及功能的变化，发现在缺乏有丝分裂原刺激的情况下以及在生物人工肝常用的猪肝细胞培养模式下该病毒释放的一般规律;对已经使用猪肝细胞进行生物人工肝治疗的患者进行了回顾性检测，并对PERV对胎肝细胞的感染性进行了初步研究。上述研究采用的方法与结果如下： 1) 初步建立了猪内源性逆转录病毒检测的方法，在猪肝脏、血清等标本均可检测到病毒序列，而HBV、HCV阳性患者及其它动物的血清和肝脏标本的检测结果均为阴性，显示了较好的特异性。 2) 对普通培养、混合凝胶及生物反应器培养的猪肝细胞进行氯化铵代谢、猪白蛋白合成等实验结果表明，在培养的早期细胞能够维持较好的生物活性。发现在缺乏有丝分裂原的刺激下，培养的不同时段均可检测到病毒释放，并可持续至细胞死亡;在反应器培养的内腔及外腔亦可检测到病毒序列的存在。 3) PCR法和RT-PCR检测显示，含PERV的猪肝细胞培养上清未能感染胎肝细胞;同时，对使用猪肝细胞型EBLSS治疗的患者进行的回顾性检测亦未有PERV感染的确切证据。由此得出以下结论：(1)初步建立了PERV的检测方法，使用该方法可对猪源性组织或细胞进行可靠、有效的监测。(2)在生物反应器培养细胞的早期，细胞能够维持较好的生物学功能，其长期活性尚需进一步研究;(3)在模拟生物人工肝进行治疗时，可检测到病毒的释放，而通常所使用的生物反应器半透膜并不能阻止病毒的透过。(4)培养猪肝细胞所释放的PERV未见能感染胎肝细胞，对已行生物人工肝治疗的患者亦未发现PERV感染的确切证据，故提示使用猪肝细胞进行生物人工肝治疗可能是安全的。

关键词：猪内源性逆转录病毒生物人工肝安全性 RT-PCR PCR 细胞培养生物反应器

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异种移植中预防传染性病原体传播的研究进展

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器官移植 2017年第5期8卷 406-409页

作者：陆赢聂惠蓉蔡志明牟丽莎中山大学广州510275 深圳市第二人民医院

异种移植中采用猪的细胞、组织和器官可能导致猪传染性病原体的转移,进而感染人受体,甚至引发人畜共患的疾病。为防止此情况发生,应对供体动物进行广泛的微生物筛选,包括细菌、病毒、真菌和其他微生物。在进行移植之前,供体猪可进行长... 详细信息

异种移植中采用猪的细胞、组织和器官可能导致猪传染性病原体的转移,进而感染人受体,甚至引发人畜共患的疾病。为防止此情况发生,应对供体动物进行广泛的微生物筛选,包括细菌、病毒、真菌和其他微生物。在进行移植之前,供体猪可进行长时间的筛选,故异种移植将比同种异体移植变得更为安全。通过实施剖腹产、接种疫苗等策略可以筛选出不转移不传播微生物的供体动物。猪内源性逆转录病毒(PERV),整合于所有猪的基因组中,上述方法不能清除PERV,因此需选择病毒低表达的猪或构建PERV表达抑制的基因修饰猪。

关键词：异种移植供体猪病原微生物戊型肝炎病毒猪巨细胞病毒猪圆环病毒猪内源性逆转录病毒清除方案

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猪作为异种器官移植供体的研究进展

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生物技术通讯 2001年第4期12卷 329-331页

作者：尹海芳李宁中国农业大学农业生物技术国家重点实验室北京100094

异种器官移植是现代和未来医学的重要研究领域之一 ,转基因猪有望为人类提供移植所需的器官。本文对猪作为异种器官移植供体的可能性、移植引起的免疫排斥反应及病毒感染等问题进行了综述和讨论。

关键词：猪异种器官移植免疫排斥反应猪内源性逆转录病毒供体病毒感染

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“万能猪”——异种器官移植的最佳对象

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百科知识 2019年第11期 9-13页

作者：沈羡云

"万能猪"是科学家们培育的一种克隆猪,其体内导致猪器官与人血不相容的猪DNA片段已被敲除,因此它们的器官可以移植到人体中。从理论上说,这种器官移植到人身上不会出现排斥反应,如果能够实现,将为深受供体短缺困扰的人类器官移植带来全... 详细信息

"万能猪"是科学家们培育的一种克隆猪,其体内导致猪器官与人血不相容的猪DNA片段已被敲除,因此它们的器官可以移植到人体中。从理论上说,这种器官移植到人身上不会出现排斥反应,如果能够实现,将为深受供体短缺困扰的人类器官移植带来全新的希望。异体器官移植的迫切性关于器官移植,目前主

关键词：器官移植手术异种器官移植超急性排斥反应异体器官移植基因编辑技术供体短缺克隆猪动物实验猪内源性逆转录病毒移植器官基因敲除灵长类克隆羊

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异种移植免疫学及其潜在风险的研究进展

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国际免疫学杂志 2008年第1期31卷 21-24页

作者：刘波詹金彪浙江大学医学院附属第二医院检验科杭州310009 浙江大学医学院生化与遗传学系

同种器官移植成功率的提高导致了供体器官的严重短缺。采用解剖学上与人类相近的动物，比如猪的器官可以解决这种危机。但从猪到人的器官移植需要克服很多障碍，包括免疫学，生理学及其伦理道德问题。超急性排斥反应是猪到人异种器官移... 详细信息

同种器官移植成功率的提高导致了供体器官的严重短缺。采用解剖学上与人类相近的动物，比如猪的器官可以解决这种危机。但从猪到人的器官移植需要克服很多障碍，包括免疫学，生理学及其伦理道德问题。超急性排斥反应是猪到人异种器官移植的首要免疫学障碍，目前主要通过敲除半乳糖α1，3半乳糖（galactose-α1，3-galactose，Gal）抗原来克服超急性排斥反应。除此之外，仍有其它的非-Gal抗原可能引起猪到人的移植物的失功，例如N-羟乙酰神经氨酸等。除了免疫学障碍，猪器官携带的病毒及可能引起的异种移植的潜在风险也不容忽视。虽然现在还没有明显的实验数据显示猪到人的病原体的感染，但当猪到人的免疫学障碍被克服后，感染将成为又一研究热点。

关键词：异种移植半乳糖α1 3半乳糖抗原猪内源性逆转录病毒

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猪逆转录病毒与生物人工肝及细胞移植

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国外医学（生物医学工程分册） 2004年第2期27卷 112-115页

作者：郭海涛王英杰第三军医大学西南医院全军感染病研究所重庆400038

生物人工肝是近年国内外治疗重型肝炎及肝脏功能衰竭的研究热点,猪肝细胞因其来源广泛、功能稳定、解剖及生理与人相近、不易患病等优点成为目前生物人工肝及细胞移植使用较多的生物材料之一,但自报道猪内源性逆转录病毒(porcineendogen... 详细信息

生物人工肝是近年国内外治疗重型肝炎及肝脏功能衰竭的研究热点,猪肝细胞因其来源广泛、功能稳定、解剖及生理与人相近、不易患病等优点成为目前生物人工肝及细胞移植使用较多的生物材料之一,但自报道猪内源性逆转录病毒(porcineendogenousretrovirus熏PERV)感染体外培养人细胞以来,跨种族间感染越来越引起人们的重视。本文拟就该病毒在生物人工肝及细胞移植中的研究进展综述如下。

关键词：猪肝细胞猪内源性逆转录病毒生物人工肝肝移植

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培育出一种特别的猪有望用于临床异种器官移植 003

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云南日报

作者：陈怡希

本报讯（记者陈怡希） 9月21日，云南农业大学魏红江教授团队与启函生物杨璐菡博士合作的“猪3.0”科研成果，在《自然》子刊《自然-生物医学工程》杂志上发表，有望用于临床异种器官移植的“猪3.0”诞生。在这项研究中，研究团队培育... 详细信息

本报讯（记者陈怡希） 9月21日，云南农业大学魏红江教授团队与启函生物杨璐菡博士合作的“猪3.0”科研成果，在《自然》子刊《自然-生物医学工程》杂志上发表，有望用于临床异种器官移植的“猪3.0”诞生。在这项研究中，研究团队培育出了一种特别的猪，具有13个独立的基?

关键词：异种器官移植灵长类猪内源性逆转录病毒

来源： cnki报纸评论

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