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Drebrin蛋白抑制剂BTP-2对猪伪狂犬病病毒增殖的影响

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中国兽医学报 2023年第9期43卷 1807-1813页

作者：王世平王金圆李昕蔓唐婷杨国宇潘佳佳河南农业大学农业农村部动物生化与营养重点实验室河南省动物生长发育调控重点实验室河南郑州450002

为研究肌动蛋白结合蛋白Drebrin在PRV感染过程的作用,采用化学药物BTP-2阻断Drebrin蛋白功能。首先,利用CCK-8检测BTP-2对PK-15细胞活力的影响。其次,利用荧光显微镜进行细胞形态观察,并利用流式细胞术、实时荧光定量PCR和Western blot... 详细信息

为研究肌动蛋白结合蛋白Drebrin在PRV感染过程的作用,采用化学药物BTP-2阻断Drebrin蛋白功能。首先,利用CCK-8检测BTP-2对PK-15细胞活力的影响。其次,利用荧光显微镜进行细胞形态观察,并利用流式细胞术、实时荧光定量PCR和Western blot等方法分别从细胞水平、基因水平和蛋白水平检测细胞内病毒感染量。此外,利用空斑形成单位法测定子代病毒滴度。结果显示,利用化学药物BTP-2阻断Drebrin蛋白功能,PRV子代病毒滴度显著降低,PRV-gB基因和蛋白表达量均下降,PRV-GFP细胞数量也明显降低,并呈剂量依赖性。结果表明,BTP-2抑制PRV增殖,说明Drebrin参与PRV增殖过程。该结果为进一步研究Drebrin参与PRV感染的分子机制奠定基础。

关键词：肌动蛋白 Drebrin蛋白 BTP-2 猪肾上皮细胞PK-15 猪伪狂犬病病毒

浙江省猪伪狂犬病病毒分离及其gD和gE基因遗传变异分析

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中国兽医学报 2022年第7期42卷 1327-1334页

作者：谢荣辉袁秀芳王雅婷安慧婷董建斐黄靖张璐徐辉赵灵燕浙江省动物疫病预防控制中心浙江杭州310018 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

对2018-2019年采自浙江省部分地区的30份猪伪狂犬病病毒阳性病料开展病毒分离鉴定,并进行分离毒株gD和gE基因克隆、测序和变异分析。结果显示,从30份样品中分离到11株猪伪狂犬病病毒;11个分离株之间的gD基因核苷酸及其推导氨基酸的同源... 详细信息

对2018-2019年采自浙江省部分地区的30份猪伪狂犬病病毒阳性病料开展病毒分离鉴定,并进行分离毒株gD和gE基因克隆、测序和变异分析。结果显示,从30份样品中分离到11株猪伪狂犬病病毒;11个分离株之间的gD基因核苷酸及其推导氨基酸的同源性分别为99.3%~99.9%和98.0%~100.0%,gE基因核苷酸及其推导氨基酸的同源性分别为99.5%~99.9%和99.0%~99.8%;遗传进化分析显示,11株猪伪狂犬病病毒与我国2011年以后流行的毒株亲缘关系较近,与2011年前分离的国内毒株亲缘关系较远,与欧美毒株的亲缘关系更远;与疫苗株Bartha相比,11个分离株的gD和gE基因均存在碱基插入和点突变现象;gE基因推导氨基酸序列第48位均存在天冬氨酸的插入。本试验结果对于了解浙江省猪伪狂犬病病毒流行毒株的分子生物学特征和变异状况具有重要的意义。

关键词：猪伪狂犬病病毒 gD基因 gE基因遗传变异

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

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华南农业大学学报 2018年第2期39卷 9-15页

作者：潘慧李艳华向柯宇唐栋程珍珠罗永文琚春梅华南农业大学兽医学院/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室广东广州510642

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV... 详细信息

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP^+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。

关键词：猪伪狂犬病病毒流行毒株基因缺失同源重组生物学特性

2016~2021年我国猪伪狂犬病病毒的分子流行病学调查与分析

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中国预防兽医学报 2023年第2期45卷 122-128,155页

作者：郭镇洋赵静付军许浒李超李宛生孙琪裴艳艳龚帮俊王倩周国辉汤艳东冷超粮王永杰陈长青安同庆蔡雪辉张洪亮田志军彭金美中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 南阳师范学院河南南阳473061 河北省威远药业有限公司河北石家庄052165

为探究近几年猪伪狂犬病病毒(PRV)在我国的流行情况及遗传演化特征,本研究对2016年~2021年采自全国17个省、市和自治区的2299份临床样品经PCR检测,并利用PCR扩增阳性样品中的PRV gB、gE和gC基因并测序,采用MegAlign分析三者与GenBank登... 详细信息

为探究近几年猪伪狂犬病病毒(PRV)在我国的流行情况及遗传演化特征,本研究对2016年~2021年采自全国17个省、市和自治区的2299份临床样品经PCR检测,并利用PCR扩增阳性样品中的PRV gB、gE和gC基因并测序,采用MegAlign分析三者与GenBank登录的PRV参考株相应基因序列的同源性;利用MEGA 7.0分别构建上述3个基因的遗传进化树,并采用MegAlign分析gB、gE和gC蛋白氨基酸序列的差异,分析其遗传演化及分子特征的变化。结果显示,共扩增出24份PRV阳性样品,阳性率约1.04%,且不同年份及不同地区均有PRV的检出。PRV gB、gE和gC基因序列的同源性及遗传进化分析结果显示,3个基因及其编码氨基酸序列均与2011年以来的PRV变异株同源性最高,且均属于基因Ⅱ型PRV变异株;氨基酸序列比对结果显示,与基因Ⅰ型PRV相比,所测PRV gB、gE和gC中均存在特征性氨基酸突变位点:gB氨基酸序列aa75~aa77连续缺失3个氨基酸(SPG),aa93~aa94连续插入2个氨基酸(DG);gE氨基酸序列在aa48和aa496各插入1个氨基酸(D);gC氨基酸序列在aa63~aa69连续插入7个氨基酸AAASTPA。此外,本研究通过比对国内外经典株以及2011年以来国内PRV gE蛋白的氨基酸序列,确定了不同亚型PRV(即指基因Ⅱ型PRV变异株和经典株)的分子特征即基因Ⅱ型PRV变异株:gE aa496为“D+”或aa496为“D-”+aa448“I”;基因Ⅱ型PRV经典株:gE为aa496“D-”+aa448“V/A”。上述结果表明,我国现阶段仍以基因Ⅱ型PRV变异株的流行为主,进一步明确了不同基因型和亚型PRV的分子特征,对了解我国PRV的流行现状及当前流行株的分子特征具有重要意义,为PRV诊断试剂的研发及PR的防控提供了参考。

关键词：猪伪狂犬病病毒变异株遗传演化分子特征

猪伪狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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养猪 2022年第6期 97-100页

作者：徐凯文廖帆雷磊谭磊湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128

当前猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)仍是猪场常见的病原之一,给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。为建立一种基于SYBR Green的PRV实时荧光定量PCR检测方法,以PRV-gE基因序列为靶标,构建pUCmT-gE重组质粒(并作为阳性质粒),... 详细信息

当前猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)仍是猪场常见的病原之一,给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。为建立一种基于SYBR Green的PRV实时荧光定量PCR检测方法,以PRV-gE基因序列为靶标,构建pUCmT-gE重组质粒(并作为阳性质粒),针对该基因设计特异性引物,并评估该方法的灵敏性、特异性和可重复性等指标。结果表明,该方法检测下限为4.545拷贝/μL,而普通PCR检测下限为4.545×10^(2)拷贝/μL;在90.0℃出现单一的溶解峰,并与PCV2(圆环病毒2型)、PPV(细小病毒)、PRRSV(蓝耳病病毒)、PEDV(流行性腹泻病毒)和TGEV(传染性胃肠炎病毒)等不产生交叉反应。此外,该方法对15份疑似感染伪狂犬病的临床样品检出率为20%(3/15),高于常规PCR检出率(13.33%,2/15)。因此,该方法较传统PCR具有更高灵敏性,更适合用于PRV的临床早期诊断。

关键词：猪伪狂犬病病毒实时荧光定量PCR 方法建立应用

猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定及致病性初步分析

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北方牧业 2023年第7期 20-21页

作者：曲信芹赵玉惠蒋皓静蒋贻海魏波青岛蔚蓝生物股份有限公司山东青岛266114 青岛蔚蓝生物制品有限公司山东青岛266114

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种烈性传染病。伪狂犬病毒是疱疹病毒科,水痘病毒属,可感染猪、犬、猫、貂、绵羊等多种动物。猪是伪狂犬病毒天然宿主,主要引起妊娠母猪流... 详细信息

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种烈性传染病。伪狂犬病毒是疱疹病毒科,水痘病毒属,可感染猪、犬、猫、貂、绵羊等多种动物。猪是伪狂犬病毒天然宿主,主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎,哺乳仔猪高死亡率及种猪不育等。许多国家用于防控伪狂犬病疫苗为gE基因缺失的弱毒疫苗,因此可通过检测gE基因或其抗体水平评价猪群PRV野毒感染的状况。

关键词：伪狂犬病毒妊娠母猪流产烈性传染病 gE基因猪伪狂犬病病毒弱毒疫苗脑脊髓炎野毒感染

猪伪狂犬病病毒LY株gD基因的克隆与核酸疫苗研究

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中国兽医学报 2008年第4期28卷 412-416,429页

作者：马凤龙王文成向华傅兴伦赵怀龙马振宇宣华济南军区疾病预防控制中心山东济南250014 辽宁省益康生物制品有限公司辽宁辽阳111000 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

将伪狂犬病病毒LY株的免疫糖蛋白基因(gD基因)分别克隆到核酸疫苗载体pIRESneo、pEGFP-C1的多克隆位点上,成功地构建了含有相应目的基因的重组质粒pIgD、pFgD和PRRSVLX-1株的E基因的双基因共表达二联核酸疫苗质粒pID-E。将构建的各核酸... 详细信息

将伪狂犬病病毒LY株的免疫糖蛋白基因(gD基因)分别克隆到核酸疫苗载体pIRESneo、pEGFP-C1的多克隆位点上,成功地构建了含有相应目的基因的重组质粒pIgD、pFgD和PRRSVLX-1株的E基因的双基因共表达二联核酸疫苗质粒pID-E。将构建的各核酸疫苗质粒,通过脂质体法分别转染到BHK-21细胞中,经ELISA检测所有目的蛋白均得到表达,表达产物也均具有一定的反应原性。小鼠免疫试验证实这些核酸疫苗质粒具有很好的免疫原性,能诱导小鼠产生特异性抗体,第3次免疫后,抗体阳性率为100%,pIgD抗体效价均不低于1∶160,最高可达1∶640。pIE与pIgD的联合应用时,不影响各自特异性抗体的产生。构建的含有PRRSVE基因和PRVgD基因的双基因共表达质粒pID-E,脂质体转染BHK-21细胞后,经ELISA检测,相应的PRRSV和PRV的目的蛋白均获得了瞬时表达;小鼠免疫试验表明E和gD2种糖蛋白基因能在小鼠体内共表达,且能诱导免疫小鼠产生针对PRRSV和PRV的相应中和抗体。上述研究为进一步探讨PRRSVE蛋白及PRVgD蛋白的免疫生物学特性,进而为开展PRRSV与PRV相关基因在哺乳动物细胞中的联合表达及基因免疫提供理论基础。

关键词：猪伪狂犬病病毒 gD基因核酸疫苗基因表达免疫

猪伪狂犬病病毒、轮状病毒、传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒多重PCR的构建及应用

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当代畜禽养殖业 2022年第2期 8-12页

作者：赵娜刘艳成刘艳龙谢家鑫吴玘瑶智宇兴安盟农牧局综合保障中心内蒙古乌兰浩特137400 兴安盟动物疫病预防控制中心内蒙古乌兰浩特137400 内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 内蒙古自治区农牧业科学院内蒙古呼和浩特010031

本试验的目的在于建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪轮状病毒(RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的多重PCR检测方法。试验设计并合成了4对特异性引物,对样品中的PRV,RV,TGEV和PEDV进行了多重PCR扩增。结果显... 详细信息

本试验的目的在于建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪轮状病毒(RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的多重PCR检测方法。试验设计并合成了4对特异性引物,对样品中的PRV,RV,TGEV和PEDV进行了多重PCR扩增。结果显示,该方法可同时扩增出PRV(497 bp),RV(1356 bp),TGEV(238 bp)和PEDV(610 bp)的特异性目的片段,而对PPV,PCV,PRRSV和HCV的PCR扩增结果均为阴性。利用建立的多重PCR检测方法和单项PCR对60份临床病料进行检测。结果显示,两者的总符合率为95.0%。表明建立的多重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于上述4种病毒的早期鉴别诊断及大规模的流行病学调查。

关键词：猪伪狂犬病病毒猪轮状病毒猪传染性胃肠炎病毒猪流行性腹泻病毒多重PCR

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表达HP-PRRSV和NADC30-Like-PRRSV GP5重组猪伪狂犬病病毒的构建及免疫原性的初步研究

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表达HP-PRRSV和NADC30-Like-PRRSV GP5重组猪伪狂犬病病毒的构建...

作者：侯承尧河南农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和各个年龄段猪呼吸系统疾病为主要特征的传染性疾病。2006年,高致病性HP-PRRSV在我国迅速传播,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。2013年我国再次出现了新型PRRSV变异株NADC30-Like-PRRSV,该毒株虽致病性低于HP-PRRSV,但极易与其它类型PRRSV毒株发生基因重组。近年来,NADC30-Like-PRRSV在我国许多规模化猪场存在与流行,成为了新的优势毒株。猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)可感染各年龄段猪群,造成猪繁殖障碍、仔猪神经系统和呼吸系统疾病。在2011年,国内出现了毒力更强的PRV变异毒株,接种过Bartha-K61疫苗的猪场也相继暴发新的PR疫情,严重地威胁我国生猪产业持续健康发展。目前,PRRS和PR的防控主要还是依靠疫苗免疫,然而PRRS和PR的经典疫苗不能对猪群提供完全保护,故急需安全有效的新型疫苗对两种疫病进行防控以及净化。为了制备安全有效且能同时防控PRRS和PR的新型疫苗,本研究拟将改造后的PRV弱毒株作为载体,以PRRSV主要抗原基因ORF5为外源基因构建重组病毒株,以期该重组病毒能够保护猪群免受PRRSV和PRV的攻击,成为能同时防控PRRS和PR的疫苗候选株。为了调查目前河南地区PRRSV的流行态势,本研究于2019到2022年采集河南省25个猪场疑似PRRSV感染的发病猪血清、肺脏等样本,共计110份,进行PRRSV检测并扩增其ORF5基因分析其亲缘性和变异性。结果显示,PRRSV总阳性率为29.09%,从阳性样本中共扩增得到的16条PRRSV ORF5基因序列,与参考序列间的核苷酸和氨基酸同源性分别为82.3%-99.3%和54.3%-99%。遗传进化分析结果显示本研究获得的15条PRRSV GP5序列在Lineage1组,与参考序列HENAN-XINX亲缘性最近。1条序列属于Lineage 8.7组,与HUN4亲缘性最近。提示河南地区的主要流行毒株为HP-PRRSV和NADC30-Like-PRRSV。本研究扩增HP-PRRSV的ORF5基因,并通过BamH I位点与实验室保存的PRV转移载体p G相连接,成功构建了转移载体p G-GP5/HP-EGFP。利用同源重组技术经10轮的蚀斑纯化,成功获得重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。使用CRISPR/Cas9-EGFP敲除质粒剪切EGFP部分基因,最终获得重组病毒rPRV-GP5/HP。RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot试验结果显示ORF5基因成功转录并得到表达。另外,为了构建表达HP-PRRSV和NADC30-Like-PRRSV ORF5基因重组猪伪狂犬病病毒,扩增NADC30-Like-PRRSV ORF5基因,通过Bam H I和Hind III位点插入真核表达载体p BApo-EF1α＿Pur＿DNA,构建p BA-GP5/NA。并扩增p BA-GP5/NA载体表达盒,利用无缝克隆技术进行连接,成功构建转移载体p G-GP5/HP-GP5/NA-EGFP。然后在CRISPR/Cas9-g G载体的辅助下,通过同源重组技术将两个ORF5基因重组到rPRV-g E/g I/TK三缺失株中,最终获得重组病毒rPRV-GP5/HP。通过RT-PCR、间接免疫荧光、Western blot试验验证,初步判定两个位点的ORF5基因都同时得到了转录和表达。本研究对两株重组病毒的理化特性、生长特性和遗传稳定性进行分析,结果表明两株重组病毒与亲本株培养特性相似,说明外源基因的插入以及复杂的重组过程对病毒的本身无影响,且两株重组病毒具有良好的遗传稳定性。本研究选用三周龄PRV和PRRSV抗原抗体双阴性仔猪作为动物模型,使用重组病毒rPRV-GP5/HP和rPRV-GP5/HP-GP5/NA对仔猪进行免疫,并设立PRRSV疫苗对照组和DMEM空白组。两株重组病毒均能刺激仔猪产生较高水平的PRV ELISA抗体和中和抗体,与商品化疫苗免疫效果相同。但两株重组病毒免疫仔猪后仅能检测到一定的ELISA抗体,抗体水平略低于商用疫苗。未检测到中和抗体,其原因尚不清楚,可能与蛋白表达量或GP5蛋白表位无法充分暴漏有关,后续还需进行进一步的探究。攻毒保护试验结果表明两株重组病毒均能对PRV和PRRSV强毒的攻击提供一定的保护效果,并能有效的抑制各个脏器中病毒的增殖。综上所述,本研究成功获得了两株重组病毒

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒 ORF5基因 CRISPR/Cas9技术重组病毒活载体疫苗免疫原性