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猪伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国兽医科学 2024年第8期54卷 1065-1071页

作者：马国祥曹丽艳张娟张宇万颖孔祥雨李想通王娅婷段月月袁聪施磊郭庆勇翟少华郑海学王琦新疆农业大学动物医学学院中国农业科学院都市农业研究所中国农业科学院兰州兽医研究所

为了制备猪伪狂犬病病毒（PRV）gB蛋白单克隆抗体，本研究利用原核表达系统表达gB蛋白的主要抗原区（540～734 aa），获得重组蛋白免疫BALB/c小鼠。利用杂交瘤技术，经过细胞筛选和亚克隆，获得1株能稳定分泌抗gB蛋白的单克隆抗体，将... 详细信息

为了制备猪伪狂犬病病毒（PRV）gB蛋白单克隆抗体，本研究利用原核表达系统表达gB蛋白的主要抗原区（540～734 aa），获得重组蛋白免疫BALB/c小鼠。利用杂交瘤技术，经过细胞筛选和亚克隆，获得1株能稳定分泌抗gB蛋白的单克隆抗体，将其命名为1C10。经间接免疫荧光试验（IFA）和免疫印迹试验（Western-blot）验证，1C10具有良好的特异性，能识别PRV感染细胞时表达的gB蛋白。亚类鉴定结果表明，1C10重链为IgG2a型，轻链为kappa型。ELISA结果表明，纯化后的腹水效价高于1∶128 000。综上，本研究成功表达了PRV gB蛋白，并制备了抗PRV gB蛋白单克隆抗体，为进一步探究PRV gB蛋白的结构和功能以及后期建立PRV诊断方法及致病机制的研究奠定了基础。

关键词：猪伪狂犬病病毒 gB蛋白原核表达单克隆抗体

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猪伪狂犬病病毒感染及复制影响因素的研究

中国预防兽医学报 2024年第6期46卷 645-652页

作者：何松汤德元曾智勇王彬黄涛毛茵茗周飘陈旭廖正波袁盛林贵州大学动物科学学院贵州贵阳550025

猪伪狂犬病(Porcinepseudorabies,PR)是由PR病毒(PRV)引起猪的病毒性传染病,对世界养猪业造成了重大经济损失。猪作为PRV唯一的自然宿主,可引起母猪产死胎、木乃伊胎和屡配不孕;公猪睾丸萎缩、精液质量下降,丧失种用功能;新生仔猪高热... 详细信息

猪伪狂犬病(Porcinepseudorabies,PR)是由PR病毒(PRV)引起猪的病毒性传染病,对世界养猪业造成了重大经济损失。猪作为PRV唯一的自然宿主,可引起母猪产死胎、木乃伊胎和屡配不孕;公猪睾丸萎缩、精液质量下降,丧失种用功能;新生仔猪高热、出现神经症状且两周龄以内的仔猪病死率可达100%[1]。2011年之前,由于Bartha-K61株疫苗在我国的广泛使用,PR在我国得到了较好的控制。但自从2011年PRV出现变异之后,现有的PR商品化疫苗只能对动物机体提供部分的免疫保护作用并且尚无特效药物治疗[2]。基于此,本文对影响PRV感染与复制的各类因素的最新研究进展作综述,以期为开发高效抗PRV的新型药物或疫苗提供参考依据。

关键词：病毒性传染病重大经济损失猪伪狂犬病病毒屡配不孕仔猪病死率自然宿主公猪睾丸神经症状

猪伪狂犬病病毒gG、gE和TK基因多重PCR检测方法的建立及应用

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动物医学进展 2024年第9期45卷 7-12页

作者：吴晓敏陈润山李华明项维徐梦然杨荣荣雷连成张付贤长江大学动物科学学院湖北荆州434023 湖北省十堰市房县畜牧兽医服务中心湖北十堰442100 吉林大学动物医学学院吉林长春130062

建立准确鉴别猪群伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)野毒株和基因缺失疫苗株高效多重PCR方法,对PRV gG、gE和TK基因保守区域设计合成特异性引物,优化反应体系和条件,建立多重PCR鉴别检测方法,对临床样品进行检测应用。结果... 详细信息

建立准确鉴别猪群伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)野毒株和基因缺失疫苗株高效多重PCR方法,对PRV gG、gE和TK基因保守区域设计合成特异性引物,优化反应体系和条件,建立多重PCR鉴别检测方法,对临床样品进行检测应用。结果成功建立了鉴别PRV gG、gE和TK基因缺失疫苗株和野毒株感染的多重PCR检测方法,该方法对PRV gG、gE和TK基因可进行特异性扩增,对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪副猪嗜血杆菌等相关病原均无扩增,对携带gG、gE和TK混合阳性质粒的最低检测限为2.5×10^(-5) ng/μL,具有良好的重复性。用该方法检测53份猪组织样品,检出PRV野毒感染的样品7份,与国标方法和单一PCR法检测结果符合率为100%。建立的猪伪狂犬病病毒野毒株和基因缺失疫苗株多重PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,在生产中可快速、高效鉴别猪群PRV野毒感染和基因缺失疫苗免疫,可为PRV的快速鉴别检测、流行病学调查和防控提供技术支持。

关键词：猪伪狂犬病病毒 gG基因 gE基因 TK基因多重PCR

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猪伪狂犬病病毒感染小鼠诱导氧化应激的研究

动物医学进展 2024年第8期45卷 22-27页

作者：周淑棉韦玉衡周家芳赵雅琪胡庭俊广西贵港市动物疫病预防控制中心广西贵港537100 广西大学动物科学技术学院广西南宁530004

旨在研究猪伪狂犬病病毒(PRV)感染小鼠后体内的氧化应激。40只昆明系小鼠设置空白对照组、PRV感染组(10^(0)TCID_(50)、10^(1)TCID_(50)、10^(2)TCID_(50)),采用肌肉注射联合滴鼻的方式感染小鼠,0.1mL/只。观察记录小鼠的临床表现,接种7... 详细信息

旨在研究猪伪狂犬病病毒(PRV)感染小鼠后体内的氧化应激。40只昆明系小鼠设置空白对照组、PRV感染组(10^(0)TCID_(50)、10^(1)TCID_(50)、10^(2)TCID_(50)),采用肌肉注射联合滴鼻的方式感染小鼠,0.1mL/只。观察记录小鼠的临床表现,接种7d后采集小鼠脑、脾脏、肺脏和胸腺。测定免疫器官指数,PCR法检测PRV,HE染色观察小鼠脑、脾脏和肺脏组织结构病理学变化;RT-PCR法检测脾脏、肺脏氧化应激指标相关指标mRNA表达水平。结果显示,感染组小鼠脑、脾、肺均检测到PRV抗原;10^(2)TCID_(50)PRV组小鼠死亡率10%,其他组均未出现死亡;PRV感染小鼠后显著降低小鼠脾脏指数,极显著降低胸腺指数,显著或极显著上调脾和肺组织中iNOS、Nrf2及脾组织中NQO1的mRNA表达水平,极显著降低脾和肺组织中Keap1、脾组织中HO-1的mRNA表达水平;HE染色显示PRV感染小鼠的脑组织出现“血管套”现象,脾脏红髓增宽,脾小体减少和消融,红髓变宽,白髓萎缩,肺脏出现间质性肺炎。结果表明,PRV感染可成功诱导小鼠体内氧化应激,PRV剂量为10^(1)TCID_(50),0.1mL/只,该结果为进一步研究伪狂犬病病毒的致病机制和筛选抗PRV感染的有效药物奠定了基础。

关键词：猪伪狂犬病病毒小鼠氧化应激

干扰素调节因子敲减细胞系的构建及其对猪伪狂犬病病毒增殖的影响

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畜牧兽医学报 2024年第9期 4100-4109页

作者：付艺乾梁东阁王铭洋潘佳佳杨彦宾曾磊康相涛河南农业大学动物医学院河南农业大学农业农村部动物生化与营养重点实验室河南农业大学河南省动物生长发育调控重点实验室河南农业大学动物科技学院

旨在揭示干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRFs)对猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)增殖的影响，本研究通过shRNA技术构建敲减IRF1-9的PK15细胞系，并检测其敲减效率。采用流式细胞术以及滴度测定检测敲减IRF1-9后... 详细信息

旨在揭示干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRFs)对猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)增殖的影响，本研究通过shRNA技术构建敲减IRF1-9的PK15细胞系，并检测其敲减效率。采用流式细胞术以及滴度测定检测敲减IRF1-9后PRV的增殖情况；利用RT-qPCR技术检测PRV感染细胞后PRV-gB、IFN-β、ISG-15和IL-6的mRNA表达水平；Western blot技术检测PRV感染细胞后gB蛋白的表达水平。敲减效率测定结果显示，PK15细胞中的IRF1-9 mRNA表达水平均有显著降低；流式细胞术及滴度测定结果表明，敲减IRF1-9基因后有助于PRV的增殖；RT-qPCR及Western blot结果证明，敲减IRF1-9基因后，PRV-gB mRNA及蛋白表达水平均有显著提高；细胞炎性因子的mRNA表达水平检测结果发现，敲减IRF1-9抑制PRV诱导的IFN-β、ISG-15以及IL-6 mRNA表达。综上所述，IRF1-9是PRV在PK-15细胞内复制的宿主限制因子。

关键词： shRNA 干扰素调节因子猪伪狂犬病病毒细胞炎性因子

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辣蓼黄酮缓解猪伪狂犬病病毒诱导的小鼠炎症及相关信号通路研究

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动物医学进展 2024年第10期 27-33页

作者：唐敏谢小东蒋丽群童艳梅任春芝易首利施君胡庭俊陆军军医大学第二附属医院检验科广西大学动物科学技术学院徐州生物工程职业技术学院

为研究辣蓼黄酮乙酸乙酯部分(ethyl acetate of flavonoids from Polygonum hydropiper L,FEA)对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)感染小鼠诱导的炎症反应及炎症相关信号通路的调节作用，以50～200 mg/kg体重的FEA处理PRV感染... 详细信息

为研究辣蓼黄酮乙酸乙酯部分(ethyl acetate of flavonoids from Polygonum hydropiper L,FEA)对猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)感染小鼠诱导的炎症反应及炎症相关信号通路的调节作用，以50～200 mg/kg体重的FEA处理PRV感染的小鼠炎症模型后，检测各组小鼠免疫器官指数变化，脾脏匀浆液中氧化应激相关因子、炎症相关因子的水平或表达量，以及NF-κB等炎症相关信号通路的活化情况。结果显示，50和200 mg/kg体重的FEA能降低PRV感染的小鼠脾脏指数(P<0.05);50～200 mg/kg体重FEA能不同程度的降低PRV感染的小鼠脾脏细胞中ROS、NO水平，IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α等细胞因子的含量及mRNA表达，以及XOD、MPO、iNOS的酶活性(P<0.05),升高IL-10的水平和GSH的酶活性(P<0.05)。此外，FEA降低了PRV感染的小鼠脾脏细胞中p-p65/p65、p-JNK/JNK和p-p38/p38等炎症相关信号通路蛋白的磷酸化比值(P<0.05)。结果表明，FEA能减缓PRV诱导的小鼠氧化应激状态和炎症反应，发挥体内抗炎作用，其可能是通过抑制NF-κB和MAPK等炎症相关信号通路的活化发挥作用。

关键词：辣蓼黄酮猪伪狂犬病病毒氧化应激炎症核因子-κB

湖南省猪伪狂犬病病毒野毒流行情况调查及遗传变异分析

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中国兽医学报 2024年第7期44卷 1356-1361页

作者：杜雅萍彭国华龙明英廖淑玲谭凯利周宇骏湖南中科基因技术有限公司衡南县向阳桥街道农业综合服务中心湖南农业大学动物医学院

为了解当前湖南省猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）流行及遗传变异情况，本研究于2021—2022年从湖南省部分地区采集18 861份血清样品和1 725份疑似感染PRV组织样品，分别采用ELISA法和qPCR检测血清样品PRV-gE抗体和组织样品... 详细信息

为了解当前湖南省猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus, PRV）流行及遗传变异情况，本研究于2021—2022年从湖南省部分地区采集18 861份血清样品和1 725份疑似感染PRV组织样品，分别采用ELISA法和qPCR检测血清样品PRV-gE抗体和组织样品PRV核酸，并统计不同年份和季节样品阳性率。同时，对15份PRV阳性样品gC基因序列进行PCR扩增、测序及序列分析，并将阳性病料接种于Vero细胞，初步探究分离株生物学特性。结果发现，2 004份血清和56份组织样品分别检测为PRV-gE抗体和PRV核酸阳性，阳性率分别为10.74%和3.25%。序列分析结果表明，15份PRV阳性样品的gC基因核苷酸和对应氨基酸序列相似性分别为98.4%～100.0%和98.8%～100.0%。遗传进化分析结果显示，13个阳性样品与已知PRV变异株同属于一个分支，而另外2个样品与已知PRV经典株聚为同一个分支。病毒分离获得1株PRV变异株，该毒株可引起Vero细胞出现典型病变，病毒最高滴度为108.2TCID50/mL。本研究揭示出PRV在湖南省各地区广泛流行，且流行基因型包括PRV变异株和经典株，其中变异株为优势流行亚型，为探究湖南省PRV分子流行病学特征及疫苗研发提供了科学依据。

关键词：猪伪狂犬病病毒血清学调查分子流行病学调查 gC基因序列分析病毒分离与鉴定

体内外评估丹酚酸A对猪伪狂犬病病毒的抗病毒作用

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体内外评估丹酚酸A对猪伪狂犬病病毒的抗病毒作用

作者：陈梓路河南农业大学

学位级别：硕士

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种高度传染性疾病,主要影响猪,但也可以感染其它多种家畜、野生动物甚至人。PRV可以引起动物的神经系统、呼吸系统和生殖系统的疾病,严重影响动物的健康和生产性能。尽管在过去的几年科研人... 详细信息

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的一种高度传染性疾病,主要影响猪,但也可以感染其它多种家畜、野生动物甚至人。PRV可以引起动物的神经系统、呼吸系统和生殖系统的疾病,严重影响动物的健康和生产性能。尽管在过去的几年科研人员一直致力于研发针对PRV的药物,但截至目前,尚未有药物来治疗PR。因此探索发现安全有效的药物对PR的预防及治疗具有重要意义。天然提取物具有结构多样、拥有更高的生物学活性与安全性、更易进入细胞发挥药效等特点,是当下药物筛选和新药研发的热门选择。此外,针对一些特殊的关键靶点,从天然化合物中筛选得到其调节剂的概率更大。本研究利用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的重组PRV,从天然化合物库中成功筛选到7种对PRV具有显著抑制作用的药物,并选择丹酚酸A（SAA）作为进一步研究的对象。我们在非洲绿猴的肾上皮细胞（Vero）和猪肾近曲小管上皮细胞（LLC-PK1）上对SAA抗PRV效果进行了初步评估,并用囊膜和非囊膜病毒探索了SAA的抗病毒方式,为抗PRV药物的研发奠定基础。1.抗PRV药物筛选利用PRV重组病毒（PRV-GFP）,初步筛选具有潜在抑制PRV增殖的天然小分子化合物。以抑制荧光值大于80%为标准,筛选出包括（-）-表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸辛酯、茶黄素-3,3'-双没食子酸、姜黄素、黄芩苷、SAA和石榴皮鞣素在内的七种具有抑制PRV增殖能力的天然化合物。然后对SAA进行细胞活性检测与剂量依赖性试验,评估药物的细胞毒性及其抗病毒效果。结果显示,SAA能显著抑制病毒增殖,化合物在Vero和LLC-PK1细胞上的最大无毒浓度（TC0）均为50μM,细胞半数致死浓度(CC50)分别为296.3μM和272.9μM。之后我们应用不同的攻毒和药物剂量进行初步抗病毒效果探究,结果表明SAA在体外能够显著抑制PRV的增殖,其抑制效果具有剂量依赖性。同时我们简单评估了其他丹参提取物,丹酚酸B与丹酚酸C抗PRV的作用效果,结果发现丹酚酸B对PRV的增殖没有抑制效果,而丹酚酸C能够抑制PRV的增殖。***对不同PRV毒株抗病毒效果评估为进一步评估SAA对不同PRV毒株的抗病毒作用,我们选用了4株不同来源的PRV毒株包括2株临床分离毒株（PRV-QXY和PRV-HN）、1株疫苗毒株（PRV-Δg E）和1株重组毒株（PRV-GFP）,在Vero和LLC-PK1两种细胞上以全处理的方式,通过测定TCID50、荧光定量PCR（q PCR）的方式对病毒增殖情况进行定量分析,并使用间接免疫荧光技术（IFA）对病毒蛋白表达进行观察,多角度评价SAA的抗病毒效果。结果显示,SAA在不同细胞上对不同PRV毒株的基因组复制、病毒蛋白合成和病毒粒子产生均有抑制作用,不具备细胞特异性与毒株特异性。***抗PRV作用方式的初步探究为了初步探究SAA对PRV的抗病毒机制,我们选用PRV-GFP、PRV-QXY两种毒株进行预处理、共处理、后处理三种处理方式,通过不同时间添加SAA来测定两种毒株在Vero细胞的感染能力并通过TCID50以及IFA初步探索抗病毒机制。结果显示,在三种处理方式中,共处理的效果最好,预处理与后处理对PRV的增殖抑制效果较差。之后我们对PRV-QXY增殖的早期阶段（吸附、内吞）以及SAA的广谱抗病毒作用进行探究,结果表明SAA影响病毒的吸附和内吞阶段,同时在预孵育条件下SAA对PEDV-GFP、VSV-GFP、PRV-GFP三种囊膜病毒具有一定抑制效果,但对非囊膜病毒柯萨奇病毒（CVB3）没有抑制效果。***体外体内直接灭活作用效果评估为探究SAA对囊膜病毒的灭活效果,我们用三种囊膜病毒（PRV-GFP、PEDV-GFP、VSV-GFP）进行灭活试验,通过核酸酶消化试验验证其灭活机制,并在体内评估SAA灭活效果。结果表明SAA通过破坏病毒囊膜来灭活囊膜病毒,经灭活后的致死剂量的病毒,皮下注入小鼠体内后小鼠死亡率与体内病毒增殖的拷贝数显著降低。

关键词：猪伪狂犬病病毒天然化合物丹酚酸A 抗病毒囊膜灭活

猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD在谷氨酸棒杆菌中的表达及优化

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江苏农业学报 2022年第6期38卷 1578-1585页

作者：惠萌萌孙曼曼刘秀霞杨艳坤白仲虎江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心江苏无锡214122 江南大学工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心江苏无锡214122

为在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中进行猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD(Glycoprotein gD of porcine pseudorabies virus)的可溶性表达,通过启动子、底盘菌株和发酵条件的优化,提高gD在***中的表达量,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯... 详细信息

为在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中进行猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD(Glycoprotein gD of porcine pseudorabies virus)的可溶性表达,通过启动子、底盘菌株和发酵条件的优化,提高gD在***中的表达量,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot方法进行表达产物的分析与鉴定,用镍离子亲和层析柱纯化产物。SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,gD在谷氨酸棒杆菌表达系统获得正确表达,相对分子质量约4.5×104,可与猪抗gD阳性血清特异性反应。摇瓶培养下最优发酵条件为诱导温度30℃,诱导时长24 h,优化后gD质量浓度可达到517 mg/L。

关键词：谷氨酸棒杆菌猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD 发酵优化