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狗脊多糖调控lncRNA GAS5维持软骨细胞外基质稳态的机制

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中华中医药杂志 2022年第12期37卷 7379-7383页

作者：付长龙梅阳阳金灵璐仲卫红邱志伟黄艳峰叶锦霞陈长兴福建中医药大学中西医结合研究院福州350122 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室福州350122 福建卫生职业技术学院福州350101 福建省康复技术重点实验室福州350003 福建中医药大学附属康复医院骨伤康复科福州350003

目的:探讨狗脊多糖通过调控lncRNA GAS5维持软骨细胞外基质稳态的机制。方法:构建lncRNA GAS5沉默软骨细胞;FISH检测lncRNA GAS5在软骨细胞中的表达情况;sh-lncRNA GAS5转染软骨细胞后,Western blot检测金属基质蛋白酶(MMP)-3、解聚蛋... 详细信息

目的:探讨狗脊多糖通过调控lncRNA GAS5维持软骨细胞外基质稳态的机制。方法:构建lncRNA GAS5沉默软骨细胞;FISH检测lncRNA GAS5在软骨细胞中的表达情况;sh-lncRNA GAS5转染软骨细胞后,Western blot检测金属基质蛋白酶(MMP)-3、解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS)-4、ADAMTS-5、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的蛋白含量表达;采用Real-time PCR和Western blot分别检测狗脊多糖对白细胞介素(IL)-1β诱导软骨细胞中lncRNA GAS5水平及相关指标蛋白含量表达。结果:经IL-1β诱导的软骨细胞中lncRNA GAS5相对拷贝数显著增多。与IL-1β+sh-NC组比较,IL-1β+sh-lncRNA GAS5组MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5蛋白表达显著降低(P狗脊多糖可降低IL-1β诱导软骨细胞中lncRNA GAS5水平(P狗脊多糖通过调控lncRNA GAS5,影响MMP-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Aggrecan表达,进而维持软骨细胞外基质趋于稳态。

关键词：骨关节炎狗脊多糖软骨细胞外基质长链非编码RNA 退变

狗脊多糖对膝骨关节炎大鼠Caspase-1/NLRP3信号通路的影响

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光明中医 2023年第23期38卷 4581-4583页

作者：梁冰赫天兰徐西林赵兵黑龙江省中医药科学院骨一科黑龙江哈尔滨150001 黑龙江中医药大学附属第二医院骨三科黑龙江哈尔滨150001

目的通过实验观察狗脊多糖对KOA模型大鼠膝关节软骨炎症及细胞氧化应激水平和Caspase-1/NLRP3的蛋白表达。方法取SD大鼠,随机分为对照、模型、狗脊多糖高、中、低剂量组,除正常组外采用关节腔内注射木瓜蛋白酶建立模型。治疗后检测血清... 详细信息

目的通过实验观察狗脊多糖对KOA模型大鼠膝关节软骨炎症及细胞氧化应激水平和Caspase-1/NLRP3的蛋白表达。方法取SD大鼠,随机分为对照、模型、狗脊多糖高、中、低剂量组,除正常组外采用关节腔内注射木瓜蛋白酶建立模型。治疗后检测血清中IL-6和TNF-α含量;检测关节研磨液白细胞数量;ELISA检测MDA、SOD含量;Western Blot法检测膝软骨组织Caspase-1/NLRP3的蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠膝关节腔液白细胞数、MDA含量升高,大鼠血清TNF-α、IL-6含量升高,SOD含量降低(P狗脊多糖高、中、低剂量组中大鼠的膝关节腔液白细胞数、MDA含量降低,大鼠血清TNF-α、IL-6含量降低,SOD含量升高(均P狗脊多糖主要通过抑制大鼠膝关节软骨组织炎症反应和氧化应激反应,并通过抑制Caspase-1/NLRP3蛋白表达治疗KOA大鼠模型。

关键词：狗脊多糖膝骨关节炎实验研究

狗脊多糖通过miR-181c调控IL-1β介导的骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡

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中国老年学杂志 2021年第11期41卷 2398-2402页

作者：孙群周河南省洛阳正骨医院河南省骨科医院综合骨一科河南洛阳471000

目的探讨狗脊多糖(CBPS)通过调节miR-181c表达调控软骨细胞增殖和凋亡的潜在机制。方法以白细胞介素(IL)-1β联合CBPS干预软骨细胞,qRT-PCR、噻唑蓝(MTT)和流式细胞仪检测细胞中miR-181c表达及细胞增殖和凋亡。检测过表达miR-181c联合I... 详细信息

目的探讨狗脊多糖(CBPS)通过调节miR-181c表达调控软骨细胞增殖和凋亡的潜在机制。方法以白细胞介素(IL)-1β联合CBPS干预软骨细胞,qRT-PCR、噻唑蓝(MTT)和流式细胞仪检测细胞中miR-181c表达及细胞增殖和凋亡。检测过表达miR-181c联合IL-1β处理对细胞增殖和凋亡的影响。采用MTT、流式细胞仪和Western印迹检测下调miR-181c表达联合CBPS对IL-1β介导的细胞增殖和凋亡及细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)-1和基质金属蛋白酶(MMP)-13蛋白表达的影响。结果IL-1β组miR-181c表达水平(0.41±0.06)明显低于Control组(1.00±0.14,t=6.709,P=0.000)。IL-1β组48 h及72 h细胞活力均明显低于Control组,而细胞凋亡率明显高于Control组(均P<0.05);miR-181c组miR-181c表达水平(4.72±0.35)明显高于miR-con组(1.06±0.12,P<0.05)。与Control组(1.00±0.08)相比,IL-1β组miR-181c表达水平(0.35±0.05)显著降低(P<0.05),IL-1β+miR-181c组miR-181c表达水平(0.81±0.11)明显高于IL-1β+miR-con组(0.38±0.07,P<0.05),基本恢复至正常水平。IL-1β组48 h及72 h细胞活力均明显低于Control组,而细胞凋亡率均明显高于Control组(均P<0.05);IL-1β+CBPS组48 h及72 h细胞活力均明显高于IL-1β+PBS组,而细胞凋亡率均明显低于IL-1β+PBS组(均P<0.05)。IL-1β组48 h、72 h细胞活力及细胞凋亡率均明显低于Control组(P<0.05);IL-1β+CBPS组48 h及72 h细胞活力及细胞凋亡率均明显高于IL-1β+PBS组(P<0.05)。IL-1β+CBPS组TNF-α及MMP-13水平明显低于IL-1β+PBS组,而TIMP-1水平明显高于IL-1β+PBS组(均P<0.05);IL-1β+CBPS+anti-miR-181c组TNF-α及MMP-13水平均明显高于IL-1β+CBPS+anti-miR-con组,而TIMP-1水平明显低于IL-1β+CBPS+anti-miR-con组(均P<0.05)。结论CBPS能够通过上调miR-181c表达,促进软骨细胞增殖并诱导凋亡,同时降低MMP-13/TIMP-1比值和TNF-α分泌。

关键词：狗脊多糖 miR-181c 骨关节炎增殖凋亡

狗脊多糖的指纹图谱及其用于胶质母细胞瘤辅助治疗的体外研究

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狗脊多糖的指纹图谱及其用于胶质母细胞瘤辅助治疗的体外研究

作者：石悦山东大学

学位级别：硕士

胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是最恶性的中枢神经系统肿瘤,预后极差,5年生存率约仅为3%。目前,替莫唑胺（temozolomide,TMZ）为胶质母细胞瘤的一线治疗药物,然而获得性的替莫唑胺耐药限制了其临床应用。胶质母细胞瘤的耐药性及肿... 详细信息

胶质母细胞瘤（glioblastoma,GBM）是最恶性的中枢神经系统肿瘤,预后极差,5年生存率约仅为3%。目前,替莫唑胺（temozolomide,TMZ）为胶质母细胞瘤的一线治疗药物,然而获得性的替莫唑胺耐药限制了其临床应用。胶质母细胞瘤的耐药性及肿瘤干细胞的存在与其难治性息息相关,亟待研发安全高效的化疗增敏剂以逆转其耐药性,提高临床疗效,改善患者预后,降低不良反应,提升患者生活质量。狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊（Cibotium barometz（L.）***.）的干燥根部,经砂烫炮制者称制狗脊,未经炮制者称生狗脊。狗脊为历代《中国药典》收载的传统中药材,具有悠久的药用历史,药理活性多样。前期实验结果显示,狗脊水提物具有良好的化疗增敏活性,因此,本研究建立定量方法,对其中5种成分进行定量分析,为探索其活性发挥的机理奠定基础。近年来,天然多糖成为肿瘤辅助治疗领域的研究热点,具有安全性强,多作用靶点,水溶性好等优点,已有香菇多糖,人参多糖等药物成功上市。而狗脊多糖目前在此方面研究仍为空白。本课题以狗脊多糖为研究对象,对其化学性质和胶质母细胞瘤化疗增敏活性进行初步研究探索。首先,对生、制狗脊中的多糖类成分分别进行提取、纯化,制得生、制粗狗脊多糖（raw Cibotium barometz polysaccharides,RCBP 及 processed Cibotium barometz polysaccharides,PCBP）,对其进行单糖组成分析及基于HPLC及NMR的多谱学化学计量学分析,结果表明,生、制狗脊多糖中主要成分的分子量分别约120 kDa及90 kDa。RCBP及PCBP具有类似的单糖组成,比例分别为甘露糖4.87%,13.77%;鼠李糖 4.51%,4.67%;葡萄糖醛酸 0.62%,1.40%;葡萄糖 70.86%,63.92%;木糖 12.29%,10.30%;阿拉伯糖 4.53%,3.63%及岩藻糖 2.3%,2.29%。主要区别在于分子量的差异。其次,采用CCK-8法评价两种多糖增强U87人胶质母细胞瘤细胞系对TMZ的敏感性能力,结果表明,二者均能够显著性增强TMZ对U87细胞的毒性,IC50由515 μM降低至376μM（PCBP）及344 μM（RCBP）,并且单独使用对U87细胞及NHA人星型胶质细胞均无明显毒性。狗脊多糖（CBPs）能够增强TMZ引起的细胞凋亡及G2/M期阻滞作用,与TMZ不同的是,它们还能够引起S期阻滞,类似地,RCBP较PCBP作用更强。进一步,采用1H NMR代谢组学方法对狗脊多糖结合TMZ对U87细胞代谢表型变化及其机制进行研究。通过正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）方法对各治疗组细胞内容物的1HNMR图谱进行多元统计分析,共鉴定并筛选得12个差异代谢物,并对其进行绝对定量分析。实验结果表明,与单用TMZ相比,RCBP结合疗法使U87细胞中丙氨酸、肌酸、谷氨酸、谷胱甘肽、甘氨酸、乳酸盐、赖氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）、牛磺酸、尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺（UDP-NAG）及肌醇水平显著性下调,进一步代谢通路富集分析结果显示,RCBP主要作用于U87细胞的谷胱甘肽代谢通路。为了证实这一实验结果,对细胞内谷胱甘肽水平及活性氧水平进行测定,结果表明,RCBP可以显著性促进细胞内谷胱甘肽耗竭,活性氧蓄积,引起细胞凋亡增加。为进一步探究其基因水平的作用机制,采用qPCR方法对相关的8个基因进行定量分析,结果显示,在基因水平RCBP能够强烈下调MGMT基因表达,增强U87细胞敏感性。综上,狗脊多糖能够通过多种途径增强U87细胞对TMZ治疗的敏感性,且生狗脊多糖相较其炮制品作用更强,有望成为辅助治疗胶质母细胞瘤的先导化合物。

关键词：狗脊多糖胶质母细胞瘤多指纹图谱化疗增敏代谢组学

狗脊多糖对软骨细胞增殖及氧自由基影响的实验研究

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狗脊多糖对软骨细胞增殖及氧自由基影响的实验研究

作者：付长龙福建中医药大学

学位级别：硕士

目的本研究旨在观察狗脊多糖对体外培养大鼠软骨细胞增殖和氧自由基的影响,为其在骨关节炎的临床应用提供理论依据。方法1、本实验用水提醇沉、Sevag法除蛋白提取纯化获得狗脊多糖,通过苯酚-硫酸比色法测定狗脊多糖含量。2、采用机械-... 详细信息

目的本研究旨在观察狗脊多糖对体外培养大鼠软骨细胞增殖和氧自由基的影响,为其在骨关节炎的临床应用提供理论依据。方法1、本实验用水提醇沉、Sevag法除蛋白提取纯化获得狗脊多糖,通过苯酚-硫酸比色法测定狗脊多糖含量。2、采用机械-酶消化法分离SD大鼠膝关节的软骨细胞,建立体外培养并鉴定软骨细胞,使用倒置显微镜镜下观察软骨细胞形态;MTT法检测狗脊多糖对软骨细胞增殖特性的影响;流式细胞术检测经狗脊多糖干预的软骨细胞周期变化的影响;RT-PCR、WesternBlot分别检测软骨细胞周期相关基因与蛋白的表达;酶联免疫吸附测定法分别检测软骨细胞液中SOD、NO、MDA的含量。结果1、狗脊多糖含量为76.91%,精密度实验RSD=1.86%,表明仪器精密度良好,且稳定性试验RSD=1.98%,平均回收率试验为95.4%,RSD=1.83%。2、第2代软骨细胞形态一致、胞核可视且清晰,生长状态良好;经甲苯胺蓝染色鉴定其胞核为蓝色;经Ⅱ型胶原染色后,阳性对照组胞浆区呈棕黄色。3、MTT实验结果显示,狗脊多糖对软骨细胞增殖具有一定的时效-量效关系,其最佳干预时间和浓度分别为48 h和200μg/ml;流式细胞术检测结果显示,与空白组比较,各实验组(100;200;400μg/ml)干预48 h后,以200 μg/ml组在G0/G1期所占细胞比例最低(P狗脊多糖对软骨细胞增殖作用具有一定的时效量效关系,其促增殖机制为通过提高软骨细胞周期中G1至S的转变率,并上调正性调控因子的基因与蛋白含量的表达。2、狗脊多糖可降低经硝普钠造模后软骨细胞中异常氧自由基含量表达,上调抗氧化因子水平,发挥抗氧化作用。

关键词：狗脊多糖软骨细胞增殖氧自由基

基于Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路探究狗脊多糖延缓大鼠椎间盘软骨细胞退变

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中华中医药杂志 2019年第7期34卷 3311-3314页

作者：付长龙梅阳阳李民叶锦霞郑春松吴广文福建中医药大学附属康复医院福州350003 福建中医药大学中西医结合研究院福州350122 福建省康复技术重点实验室福州350003 福建卫生职业技术学院福州350101

目的:从Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路探讨狗脊多糖对白介素-1β(IL-1β)诱导大鼠椎间盘软骨细胞退变的影响。方法:①狗脊多糖的制备;②软骨细胞体外培养体系建立与鉴定;③RT-PCR、Western Blot法分别检测IL-1β诱导软骨细胞Ras、Raf、... 详细信息

目的:从Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路探讨狗脊多糖对白介素-1β(IL-1β)诱导大鼠椎间盘软骨细胞退变的影响。方法:①狗脊多糖的制备;②软骨细胞体外培养体系建立与鉴定;③RT-PCR、Western Blot法分别检测IL-1β诱导软骨细胞Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2 mRNA与蛋白含量表达。④酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠椎间盘软骨细胞上清液超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)表达。结果:大鼠椎间盘软骨细胞经Ⅱ型胶原法染色后,阳性对照组胞浆区域浸染为棕黄色。RT-PCR、Western Blot结果显示,与模型组比较,狗脊多糖100、200、400μg/m L组Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2 mRNA与蛋白含量表达均呈降低趋势(P狗脊多糖100、200、400μg/mL组NO表达含量表达均低于模型组,而SOD表达含量均显著高于模型组(P狗脊多糖可通过下调退变关节软骨中Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2 mRNA与蛋白含量及降低NO水平,上调SOD水平,来延缓大鼠椎间盘软骨细胞退变。

关键词：椎间盘软骨细胞狗脊多糖 Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路退变

狗脊多糖对硝普钠诱导退变大鼠软骨细胞氧自由基影响的研究

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风湿病与关节炎 2018年第6期7卷 5-9,14页

作者：付长龙梅阳阳李民黄志强黄艳峰林晴郑春松叶锦霞福建中医药大学附属康复医院福建福州350003 福建省康复技术重点实验室福建福州350003 福建卫生职业技术学院福建福州350101 福建中医药大学福建福州350122

目的:观察狗脊多糖对硝普钠(SNP)诱导退变大鼠软骨细胞氧自由基的影响,为其在骨关节炎的临床应用提供理论依据。方法:采用水提醇沉法、Sevag法除蛋白提取纯化获得狗脊多糖,苯酚-硫酸比色法测定其多糖含量;酶联免疫吸附测定法分别检测体... 详细信息

目的:观察狗脊多糖对硝普钠(SNP)诱导退变大鼠软骨细胞氧自由基的影响,为其在骨关节炎的临床应用提供理论依据。方法:采用水提醇沉法、Sevag法除蛋白提取纯化获得狗脊多糖,苯酚-硫酸比色法测定其多糖含量;酶联免疫吸附测定法分别检测体外培养大鼠软骨细胞空白对照组、模型对照组、各剂量狗脊多糖组(100,200,400,800μg·mL^(-1))的超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)的含量。结果:狗脊多糖含量为76.91%,精密度试验RSD=1.86%,表明仪器精密度良好,且稳定性试验RSD=1.98%,平均回收率试验为95.4%,RSD=1.83%;酶联免疫吸附法检测经SNP造模后软骨细胞氧自由基表达结果显示,与空白对照组比较,模型对照组SOD、NO、MDA含量表达差异均有统计学意义(P狗脊多糖组(100,200,400,800μg·mL^(-1))干预48 h后,可上调SOD含量,下调NO、MDA含量,其中以200μg·mL-1组表达最显著(P狗脊多糖的含量测定方法;狗脊多糖可降低经SNP造模后软骨细胞中异常氧自由基含量表达,上调抗氧化因子水平,发挥抗氧化作用。

关键词：骨关节炎膝狗脊多糖软骨细胞氧自由基大鼠