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犬布鲁氏菌菌壳疫苗株的构建及实验免疫研究

犬布鲁氏菌菌壳疫苗株的构建及实验免疫研究

作者：钱晶吉林农业大学

学位级别：硕士

犬布鲁氏菌为粗糙型球杆菌，是布鲁氏菌属中重要的生物型，不仅能感染各种犬，而且能感染人和其它动物，由该菌引起的布鲁氏菌病是一种人兽共患的自然疫源性疾病。犬布鲁氏菌病多为接触性感染，可以通过破损的皮肤粘膜和呼吸道传染，但... 详细信息

犬布鲁氏菌为粗糙型球杆菌，是布鲁氏菌属中重要的生物型，不仅能感染各种犬，而且能感染人和其它动物，由该菌引起的布鲁氏菌病是一种人兽共患的自然疫源性疾病。犬布鲁氏菌病多为接触性感染，可以通过破损的皮肤粘膜和呼吸道传染，但主要的传播途径是消化道传染。感染犬种布鲁氏菌后有的无明显临床症状，呈隐性带菌状态;有的以生殖系统侵害为特征，如流产、睾丸炎、附睾炎，同时也伴有淋巴结炎、关节炎等症状。细菌菌壳是一种缺少细胞浆和核酸而导致无繁殖能力的细菌空壳形态。自然形成的菌壳是由感染了噬菌体PhiX174的大肠杆菌在溶菌周期由于宿主细胞裂解而形成的;人为制备菌壳技术主要利用基因工程技术依赖大肠杆菌噬菌体PhiX174的裂解基因E的表达产物在其寡聚化、构象改变及其它生化反应使大多数革兰氏阴性细菌形成一个40-200nm直径的跨膜孔道，导致宿主菌的细胞浆和核酸等细胞内容物在渗透作用下外流而溶菌形成菌壳。由于菌壳技术制备菌壳的过程中没有蛋白变性，细菌菌壳保留了与活菌完全一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，从而没有任何免疫原性的改变，是一种新型非变性灭活菌苗，比传统甲醛灭活菌苗在理论上具有更好的免疫原性和免疫保护效果。本研究首先构建了具有温控裂解功能的广宿主表达质粒pBBR1MCS-2-TLC，将其电转入犬布鲁氏菌中，筛选并得到了质粒型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株，该菌株在传至第18代时出现质粒丢失导致其无法生长。而为了克服质粒在布鲁氏菌中的遗传不稳定问题，本研究结合同源重组技术，构建了温控裂解型自杀质粒pBK-CMV-SacB-B0419-TLC1，将温控裂解部件定向插入至犬布鲁氏菌基因组中，利用Kan和SacB基因的正、负向筛选标记，成功构建了基因组型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株，该疫苗株为无抗性菌株，避免了抗性基因的存在，并且传至第30代仍具有良好的遗传稳定性。接着，对两种犬布鲁氏菌菌壳疫苗株的溶菌动力学进行试验分析，经诱导条件优化，质粒型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株培养至OD600值约为1.2时，诱导30h后可制备得到裂解率达100%的犬布鲁氏菌菌壳，菌壳数约为5.30×1010个/mL;基因组型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株培养至OD600值约为0.6时，诱导60h后可制备得到裂解率达100%的犬布鲁氏菌菌壳，菌壳数约为4.70×109个/mL。电镜观察犬布鲁氏菌菌壳可见细胞内容物经裂解孔道流失，并保留了完整的表面结构。综合考虑，基因组型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株更适合作为犬布鲁氏菌病疫苗候选株。此外，探究了裂解蛋白E对布鲁氏菌的裂解效率可能与E基因的表达量、布鲁氏菌的生长状态以及其表型有着密切关联。最后，为了探究犬布鲁氏菌菌壳作为新型疫苗的应用价值，本试验分别对质粒型和基因组型犬布鲁氏菌菌壳的安全性和免疫原性进行评价。观察免疫小鼠生理状态和脾脏指数、克脾指数可得，两种犬布鲁氏菌菌壳不含任何活菌，且对小鼠无毒副作用，表明这两种犬布鲁氏菌菌壳具有良好的安全性。另外，犬布鲁氏菌菌壳免疫小鼠后，通过对小鼠血清抗体消长规律监测结果可知，犬布鲁氏菌菌壳能有效地产生特异性体液免疫，在第十周后还保持稳定的抗体效价，其中质粒型菌壳组（PBCG）和基因组型菌壳组（GBCG）的抗体水平能维持至少8周，而甲醛灭活组（FKB）和S2疫苗组（S2）的抗体水平分别只能维持3周和6周;小鼠脾淋巴细胞亚群检测分析则表明犬布鲁氏菌菌壳能诱导机体产生Th1型的细胞免疫应答;细胞因子体外实验结果显示菌壳组IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌水平均显著高于空白对照组，IFN-γ、IL-2显著高于甲醛灭活组，IL-10显著高于S2疫苗组和甲醛灭活组，且两种犬布鲁氏菌菌壳组之间无显著差异，这说明犬布鲁氏菌菌壳可有效激起与S2疫苗株相当的细胞免疫反应。用犬布鲁氏菌RM6/66株攻毒免疫小鼠，结果表明基因组型犬布鲁氏菌菌壳在小鼠体内能提供良好的免疫保护力，免疫保护单位为2.37;用羊布鲁氏菌16M株攻毒免疫小鼠，基因组型犬布鲁氏菌菌壳则能提供部分的免疫保护力，免疫保护单位为1.60。综上所述，本研究成功构建了质粒型和基因组型犬布鲁氏菌菌壳疫苗株，经诱导条件优化制备了表面结构完整的犬布鲁氏菌菌壳，该菌壳作为新型犬布鲁氏菌病灭活疫苗具有良好的安全性和免疫原性，应用前景十分广阔。

关键词：犬布鲁氏菌菌壳疫苗株溶菌动力学安全性免疫原性

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犬布鲁氏菌免疫程序设计

饲料与畜牧 2019年第6期 71-74页

作者：封伟杰连世存宋杰李明瑶徐三思赵初恒张英夏青娟辽宁禾丰牧业股份有限公司辽宁沈阳西安市动物卫生监督所陕西西安吉林大学和平校区动物科学学院吉林长春长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春

本研究旨在制定出灭活犬种布鲁氏菌的免疫BALb/C小鼠的最佳免疫程序。选用40只6~8周BALb/C雌性小鼠,随机分为试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组,每组10只。制定3种不同的免疫程序,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组三免7 d后尾部采血测血清效价,Ⅲ组四免后小鼠尾... 详细信息

本研究旨在制定出灭活犬种布鲁氏菌的免疫BALb/C小鼠的最佳免疫程序。选用40只6~8周BALb/C雌性小鼠,随机分为试验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组及对照组,每组10只。制定3种不同的免疫程序,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组三免7 d后尾部采血测血清效价,Ⅲ组四免后小鼠尾部采血测定血清效价。结果表明,3种免疫程序均可行,其中Ⅱ组免疫程序最佳。即首次免疫剂量为1×10~9 CFU/只,抗原与佐剂等比例乳化;两周后进行二免,剂量为2×10~9 CFU/只,抗原与佐剂等比例乳化;两周后进行三免,剂量为3×10~9 CFU/只,抗原与佐剂等比例乳化,融合前3 d不加佐剂加强免疫,剂量为4×10~9 CFU/只。

关键词：犬布鲁氏菌免疫程序细胞融合

犬布鲁氏菌病的组织病理学观察及病原分布检测

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南京晓庄学院学报 2018年第6期34卷 1-5页

作者：李平涂蕊朱子琦刘新肖启程彭广能钟志军邛崃市农业和林业局四川邛崃611530 四川农业大学动物医学院动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130 遂宁市农业局四川遂宁629000

布鲁氏菌病主要引起公犬的睾丸炎、附睾炎并造成不育.该文对一例患布病公犬各器官的组织进行了病理学以及抗原分布分析.结果表明,肝脏、脾脏、睾丸、淋巴结呈现广泛的炎性细胞浸润与实质细胞变性坏死,脾脏中观察到大量感染性肉芽肿.免... 详细信息

布鲁氏菌病主要引起公犬的睾丸炎、附睾炎并造成不育.该文对一例患布病公犬各器官的组织进行了病理学以及抗原分布分析.结果表明,肝脏、脾脏、睾丸、淋巴结呈现广泛的炎性细胞浸润与实质细胞变性坏死,脾脏中观察到大量感染性肉芽肿.免疫组化结果表明,布鲁氏菌抗原主要分布于肝、脾、睾丸组织中的巨噬细胞和中性粒细胞胞浆中,与巨噬细胞的亲和力最强.

关键词：犬布鲁氏菌组织病理学免疫组化

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犬布鲁氏菌菌壳疫苗的制备

中国畜牧兽医 2014年第1期41卷 38-43页

作者：钱晶尹秋丹卜昭阳陈思王兴龙王秀然郎需龙王晓旭吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122

菌壳技术是一种新型的灭活疫苗制备方法,通过非变性的灭活方式保存细菌表面多个抗原表位,所制备的菌壳可作为预防细菌病的理想疫苗。本试验从噬菌体PhiX174DNA钓取裂解E基因,连接至温控原核表达载体pBV220,通过PCR在所构建的pBV220+E上... 详细信息

菌壳技术是一种新型的灭活疫苗制备方法,通过非变性的灭活方式保存细菌表面多个抗原表位,所制备的菌壳可作为预防细菌病的理想疫苗。本试验从噬菌体PhiX174DNA钓取裂解E基因,连接至温控原核表达载体pBV220,通过PCR在所构建的pBV220+E上扩增出蛋白裂解部件(protein lysis component,PLC),该部件包含阻遏蛋白cI857、溶菌E基因及终止序列rrnbT1T2,然后将其克隆至广宿主表达载体pBBR1MCS-2中,最终将构建的广宿主裂解质粒pBBR+PLC电转入犬布鲁氏菌RM6/66中。试验结果表明,经42℃诱导后,广宿主裂解质粒对犬布鲁氏菌RM6/66的裂解率达100%,成功制备了犬布鲁氏菌RM6/66菌壳疫苗。本试验通过菌壳技术制备的犬布鲁氏菌疫苗对预防宠物犬布鲁氏菌病起到重要作用,同时也对人兽布鲁氏菌疫苗的研制提供新策略。

关键词：犬布鲁氏菌菌壳疫苗

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犬布鲁氏菌病的实验室诊断

上海实验动物科学 1988年第4期 256-256页

作者：张爱民林至刚张三思上海动植物检疫所上海医科大学实验动物部

1966年,美国的Carmichael最先从流产的母犬体分离到了犬布鲁氏菌。我国则首次从进口犬中分离到犬型布鲁氏菌并于以正式报导是在1982年。随着医学实验用犬的发展和国内外实验犬、工作犬、军犬、玩赏犬交流的扩大,在进出口岸检疫中加强犬... 详细信息

1966年,美国的Carmichael最先从流产的母犬体分离到了犬布鲁氏菌。我国则首次从进口犬中分离到犬型布鲁氏菌并于以正式报导是在1982年。随着医学实验用犬的发展和国内外实验犬、工作犬、军犬、玩赏犬交流的扩大,在进出口岸检疫中加强犬布鲁氏菌检查和控制是必要的。一、主要材料 1.犬血清样品2～5毫升。从静脉采血,立即置于冰瓶,迅速送实验室,分离血清备用。 2.犬布鲁氏菌诊断抗原和阳性对照血清。(中国

关键词：犬布鲁氏菌实验室狗布鲁氏菌布病布鲁氏菌病血清效价

犬布鲁氏菌抗体阳性犬部分器官超微结构的观察

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实验动物与比较医学 1998年第2期18卷 55-55页

作者：刘雄伟陆国平王伟兰上海实验动物研究中心

犬布鲁氏菌抗体阳性犬部分器官超微结构的观察刘雄伟陆国平王伟兰（上海实验动物研究中心，上海２０００３２）自１９６６年Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ［１］首次报道犬布鲁氏菌（Ｂｒｕｃｅｌａｃａｎｉｓ）引起犬流产以来，有许多国家相继... 详细信息

犬布鲁氏菌抗体阳性犬部分器官超微结构的观察刘雄伟陆国平王伟兰（上海实验动物研究中心，上海２０００３２）自１９６６年Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ［１］首次报道犬布鲁氏菌（Ｂｒｕｃｅｌａｃａｎｉｓ）引起犬流产以来，有许多国家相继报道了本病。犬感染布鲁氏菌后的表现...

关键词：犬布鲁氏菌刘雄狗布鲁氏菌抗体阳性超微结构器官

用微量凝集试验对显性布鲁氏菌抗原的快速鉴定

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动物医学进展 1985年第6期 34-34页

作者：付启勇

有关表面抗原A或M的鉴别试验已用于流产布鲁氏菌,马尔他热布鲁氏菌和猪流产布鲁氏菌的生物型分类。光滑型布鲁氏菌A抗原与M抗原的比率随其生物型的不同而异。粗糙型布鲁氏菌则缺乏这些抗原。试管凝集试验(TAT)用于显性表面抗原的鉴别已... 详细信息

有关表面抗原A或M的鉴别试验已用于流产布鲁氏菌,马尔他热布鲁氏菌和猪流产布鲁氏菌的生物型分类。光滑型布鲁氏菌A抗原与M抗原的比率随其生物型的不同而异。粗糙型布鲁氏菌则缺乏这些抗原。试管凝集试验(TAT)用于显性表面抗原的鉴别已得出肯定结果。由于这种方法比较快速,使用试剂少以及可得出均恒可靠的结果,所以将是一种有用的方法。本报告旨在建立一种显微镜凝集试验(MAT),并将试验结果与TAT的结果比较例。

关键词：布鲁氏菌抗体抗血清特异性单价粗糙型稀释液表面抗原犬布鲁氏菌狗布鲁氏菌试管凝集试验