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实时荧光定量PCR检测金山醋酸乳杆菌的方法与应用

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微生物学报 2021年第10期61卷 3211-3221页

作者：孙佳陆震鸣张晓娟柴丽娟史劲松许正宏江南大学工业生物技术教育部重点实验室生物工程学院江苏无锡214122 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 江南大学药学院江苏无锡214122 国家固态酿造工程技术研究中心四川泸州646000

【目的】建立基于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的金山醋酸乳杆菌特异性检测方法,并将其应用于食醋和白酒发酵过程样品的快速检测。【方法】筛选金山醋酸乳杆菌基因组中特异性强的基因序列作为模板设计特异性引物,通过标准菌株、醋醅样品进... 详细信息

【目的】建立基于实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的金山醋酸乳杆菌特异性检测方法,并将其应用于食醋和白酒发酵过程样品的快速检测。【方法】筛选金山醋酸乳杆菌基因组中特异性强的基因序列作为模板设计特异性引物,通过标准菌株、醋醅样品进行PCR验证引物的特异性和准确性,建立RT-qPCR方法分析金山醋酸乳杆菌在不同地区酒醅、醋醅和食醋样品中的含量。【结果】以金山醋酸乳杆菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基(编码phe S基因)为参考序列,设计了一对GC含量55%、T_(m)值59℃、可扩增199 bp片段的引物。建立的RT-qPCR方法特异性强、灵敏度高且重复性好,检测浓度范围为2.24-10.24 lg(copies/μL),成功应用于4个地区的酒醅、醋醅和食醋样品检测。对镇江香醋醋酸发酵过程的研究表明,醋醅中的金山醋酸乳杆菌数量先迅速增加,随后稳定在10^(8) copies/g干醅。【结论】本研究建立的RT-qPCR方法可对食醋和白酒发酵过程中金山醋酸乳杆菌进行特异性鉴定和快速定量。

关键词：镇江香醋金山醋酸乳杆菌特异性引物 RT-qPCR

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鹿茸线粒体DNA的指纹鉴定研究

中国药学杂志 2013年第3期48卷 170-173页

作者：谷玉娟张丽华傅桂莲北华大学药学院吉林吉林132013 北华大学检验学院吉林吉林132013

目的通过鹿茸特异性引物鉴别和随机扩增多态DNA(RAPD)鉴别的比较,选择一种更简便的方法用于鉴别鹿茸。方法采用盐析法从梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸、市售鹿茸等样品中抽提线粒体DNA,并应用试剂盒进行纯化。进行特异性引物扩增和序列测定... 详细信息

目的通过鹿茸特异性引物鉴别和随机扩增多态DNA(RAPD)鉴别的比较,选择一种更简便的方法用于鉴别鹿茸。方法采用盐析法从梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸、市售鹿茸等样品中抽提线粒体DNA,并应用试剂盒进行纯化。进行特异性引物扩增和序列测定,同时进行随机扩增多态DNA扩增。结果梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸以及部分市售鹿茸经特异性引物扩增后均可在琼脂糖凝胶中显示313 bp片段,只是条带亮度不同。而其余市售鹿茸无扩增条带;随机扩增多态DNA不仅有效显示阳性与阴性的DNA扩增结果,而且对梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸的聚合酶链反应产物的差异,以不同的条带数目和条带亮度得以验证。结论随机扩增多态DNA鉴别鹿茸真伪的方法更准确快捷,通过随机扩增多态DNA扩增后主条带与梅花鹿茸或马鹿茸扩增的条带大小和亮度一致,则为正品;如不一致,则为《中国药典》规定外的鹿茸或其他混淆品。这种方法对于筛选、甄别市售动物中药材,特别是名贵中药具有广阔的应用前景。

关键词：鹿茸特异性引物随机扩增多态DNA 聚合酶链反应

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中药材川贝母DNA指纹鉴定研究

中国药学杂志 2011年第1期46卷 14-16页

作者：谭莹张丽华李明成王冰梅北华大学药学院吉林吉林132013 北华大学检验学院吉林吉林132013

目的建立川贝母DNA指纹鉴别方法。方法采用CTAB法从川贝母等样品中提取基因组DNA,对其5s rDNA区序列进行扩增并在此基础上展开了分子鉴定研究。经Primer Primer5.0引物设计软件设计川贝母的特异性引物,利用PCR技术对川贝母与其他品种的... 详细信息

目的建立川贝母DNA指纹鉴别方法。方法采用CTAB法从川贝母等样品中提取基因组DNA,对其5s rDNA区序列进行扩增并在此基础上展开了分子鉴定研究。经Primer Primer5.0引物设计软件设计川贝母的特异性引物,利用PCR技术对川贝母与其他品种的贝母进行鉴别比较。结果川贝母能扩增出274bp大小的片段,而其他贝母未能扩增出相应片段。结论川贝母DNA具有特异性指纹特征,可作为川贝母与其伪品鉴定的有效方法,该方法简便快速、结果可靠。

关键词：川贝母特异性引物 DNA指纹特征

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柑橘黑斑病菌的分子检测技术研究

华北农学报 2017年第5期32卷 130-135页

作者：王兴红中国林业科学研究院华北林业实验中心北京102300 浙江大学农业与生物技术学院浙江杭州310058

为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌,在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物,以ITS4作为下游引物,并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选... 详细信息

为了快速区分柑橘黑斑病菌、亚洲柑橘叶点霉菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌,在ITS1和18S区域设计了针对柑橘黑斑病菌、首都叶点霉菌和中国柑橘叶点霉菌的上游引物,以ITS4作为下游引物,并对所设计引物的特异性和退火温度进行了筛选,对引物的灵敏度进行了验证,并进行了果园疑似病斑的检测。结果表明,在退火温度为60℃时,引物Pc1/ITS4仅能从柑橘黑斑病菌中扩增出593 bp的特异性条带,引物Pct4/ITS4仅能从首都叶点霉菌中扩增出551 bp的条带,引物Pcc1/ITS4仅能从中国柑橘叶点霉菌中扩增出706 bp的条带,不能从柑橘常见病害病原菌中扩增出任何条带。特异性引物的灵敏度检测结果表明,引物Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的检测灵敏度为200 pg,引物Pcc1/ITS4的检测灵敏度为20 pg。筛选的特异性引物Pc1/ITS4可以对果园疑似柑橘黑斑病病斑进行检测。因此,利用设计的特异性引物Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pcc1/ITS4,结合简单的病原菌基因组DNA提取方法,可以在短时间内完成对病原菌的分子检测。

关键词：柑橘黑斑病柑橘黑斑病菌中国柑橘叶点霉菌首都叶点霉菌特异性引物

新疆4种林木腐烂病菌PCR快速检测技术研究

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新疆农业科学 2016年第10期53卷 1843-1849页

作者：郭开发姚兆群吴彩兰向本春赵思峰新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室/石河子大学农学院新疆石河子832003

【目的】建立新疆林木腐烂病菌的快速PCR检测方法,为新疆林木腐烂病的早期测报和防治提供技术依据。【方法】针对新疆林木腐烂病菌主要种苹果黑腐皮壳(Valsa mali),污黑腐皮壳(Valsa.sordida),Leucostoma niveum和Valsa.malicola的r DNA... 详细信息

【目的】建立新疆林木腐烂病菌的快速PCR检测方法,为新疆林木腐烂病的早期测报和防治提供技术依据。【方法】针对新疆林木腐烂病菌主要种苹果黑腐皮壳(Valsa mali),污黑腐皮壳(Valsa.sordida),Leucostoma niveum和Valsa.malicola的r DNA-ITS特异性区段设计属专化型引物和种特异性引物。【结果】属专化型引物VF/VR可以从腐烂病菌中扩增一条424 bp的条带,检测灵敏度为10 pg/m L;设计的4对种特异性引物分别可对4种腐烂病菌V.mali,V.sordida,L.niveum,V.malicola检测到263 bp、423 bp、307 bp、308 bp的条带,检测灵敏度均为10 pg/m L。【结论】采用腐烂病菌Valsa的r DNA-ITS特异性区段设计的引物及PCR方法,可用于新疆林木腐烂病的快速分子检测。

关键词：林木腐烂病菌 r DNA-ITS PCR检测特异性引物

养殖水体三种大型爆发性海洋藻类孢子/配子实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用初探

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中国海洋大学学报（自然科学版） 2018年第8期48卷 68-76页

作者：缪栋苏蕾张倩倩包卫洋龚骏扬州大学环境科学与工程学院江苏扬州225000 中国科学院烟台海岸带研究所山东烟台264003

一些大型海洋藻类在近海养殖环境中快速生长且容易形成青苔,严重威胁到养殖生物的安全并可能带来巨大的经济损失。检测青苔孢子的数量与动态,理解青苔爆发的环境生态学机制是防控与预警的基础。使用PCR方法,利用特异性引物对非爆发期的... 详细信息

一些大型海洋藻类在近海养殖环境中快速生长且容易形成青苔,严重威胁到养殖生物的安全并可能带来巨大的经济损失。检测青苔孢子的数量与动态,理解青苔爆发的环境生态学机制是防控与预警的基础。使用PCR方法,利用特异性引物对非爆发期的生物量进行检测,是监控有害藻类的有效方法。本工作针对海参养殖池塘三种常见的青苔藻(两种石莼Ulva cf.linza,Ulva sp.和萱藻Scytosiphon lomentaria)设计了以核糖体转录间隔区(ITS)为靶区域的种类特异性PCR引物,通过藻类和环境水样DNA对照实验检验其特异性和适用性。本工作建立了实时荧光定量PCR(qPCR)方法检测养殖水体中藻类孢子/配子体含量,并实验得出该方法在三种藻类中的最低检出量,可最低检出200~400ITS rDNA拷贝。使用qPCR方法对烟台海参养殖水体2014年12月—2016年3月6个季度环境水样中的萱藻孢子/配子进行了定量检测,发现样品中萱藻孢子/配子ITS拷贝数的季节变化与青苔爆发规律呈现较高的吻合度,萱藻爆发前期伴随水体中孢子/配子量的增高,初步显示藻类爆发可用qPCR方法预测。

关键词：藻类爆发石莼萱藻特异性引物孢子配子 ITS rDNA 实时荧光定量PCR

利用多重PCR技术同时检测6种棉花转化体的方法研究

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棉花学报 2017年第5期29卷 487-494页

作者：李忆尹全刘勇四川民族学院环境与生命科学系四川康定626001 四川省农业科学院分析测试中心成都610066 四川省农业科学院植物保护研究所成都610066

【目的】建立1种转基因棉花多重聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。【方法】试验选择6种转基因棉花作为多重PCR检测对象,通过引物终浓度配比和引物退火温度的两要素全组合优化多重PCR反应体系,并分析方法灵敏度... 详细信息

【目的】建立1种转基因棉花多重聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测方法。【方法】试验选择6种转基因棉花作为多重PCR检测对象,通过引物终浓度配比和引物退火温度的两要素全组合优化多重PCR反应体系,并分析方法灵敏度。【结果】多重PCR较优的MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLCOTTON25、MON531引物终浓度为0.25、0.30、0.25、0.16、0.30、0.20μmol·L-1,较优引物退火温度为56℃,方法灵敏度为66个拷贝棉花基因组。利用盲样对上述体系的验证结果显示,所有盲样扩增条带与其含有的转基因转化体完全一致。【结论】本研究建立的体系可用于6种棉花转化体的快速检测。

关键词：棉花多重PCR 特异性引物检测

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使用ERIC-PCR技术检测嗜酸乳杆菌

沈阳药科大学学报 2017年第9期34卷 783-787,795页

作者：侯少阳张玉谢君程娟章朦玥张怡轩沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳110016

目的利用ERIC(enterobacterial repetitive intergenic consensus)-PCR技术,设计引物,特异性检测嗜酸乳杆菌。方法以本实验室保藏的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)SYP-B2340基因组DNA为模板,通过四因素三水平正交试验,优化嗜酸乳杆菌ERIC-PCR反应体系,对所获得的PCR条带进行测序和分析,进一步设计特异性引物,实现对嗜酸乳杆菌的特异性鉴别。结果通过四因素三水平正交实验,成功优化ERIC-PCR反应条件;根据ERIC-PCR片段,设计三对特异性引物,可在多种混合基因组DNA中灵敏鉴别出嗜酸乳杆菌。结论基于ERIC-PCR设计的特异性引物,可简便、快速的鉴定嗜酸乳杆菌。

关键词： ERIC-PCR 嗜酸乳杆菌特异性引物鉴别

中国对虾素在大肠杆菌(Escherichia coli)中的重组表达

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海洋与湖沼 2005年第3期36卷 235-240页

作者：薛剑峰康翠洁王金星赵小凡相建海山东大学生命科学学院济南250100 中国科学院海洋研究所青岛266071

中国对虾素是从中国对虾血细胞中克隆得到的一种抗菌肽。为了进一步研究中国对虾素(CHP)的功能并为制备特异性抗体作准备,采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,进行了对虾素原核表达的研究。根据从中国对虾血细胞中克隆得到的对虾素基因设... 详细信息

中国对虾素是从中国对虾血细胞中克隆得到的一种抗菌肽。为了进一步研究中国对虾素(CHP)的功能并为制备特异性抗体作准备,采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,进行了对虾素原核表达的研究。根据从中国对虾血细胞中克隆得到的对虾素基因设计特异性引物扩增中国对虾素成熟肽基因(Chp),插入原核表达载体pGEX4T1中,在E.coliBL21表达融合蛋白GSTCHP。结果表明,不同表达菌株的融合蛋白表达量为30%—34%,同一菌株在诱导5h后能达到最高表达量。利用GST亲和层析纯化融合蛋白,将融合蛋白用凝血酶裂解以得到CHP,其分子量约为5.6kDa,N端测序结果与期望的成熟对虾肽序列一致。用液体生长抑制方法检测活性,表明重组GSTCHP蛋白及CHP均表现出对大肠杆菌的抑菌活性。

关键词：中国对虾重组表达融合蛋白大肠杆菌表达原核表达载体 E.coli 特异性抗体特异性引物外源蛋白基因设计层析纯化抑制方法抑菌活性血细胞表达量 CHP 抗菌肽成熟肽 GST 酶裂解分子量克隆菌株凝血测序