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中国森林病虫 2024年

作者：王浩然柯思恺许璐瑶李紫博张飞萍吴松青生态公益林重大有害生物防控福建省高校重点实验室福建农林大学林学院福建农林大学生命科学学院

为探究嗜虫耶尔森氏菌Yersinia entomophaga(CSLH88)对哺乳动物的毒害作用，通过对7周龄SPF（无特定病原体，specific pathogen free）级ICR小鼠的急性经口毒性试验和急性经口致病性试验，设计特异性引物，检测小鼠各组织的菌残留体内... 详细信息

为探究嗜虫耶尔森氏菌Yersinia entomophaga(CSLH88)对哺乳动物的毒害作用，通过对7周龄SPF（无特定病原体，specific pathogen free）级ICR小鼠的急性经口毒性试验和急性经口致病性试验，设计特异性引物，检测小鼠各组织的菌残留体内情况，评估嗜虫耶尔森菌是否可作为携带防治松墨天牛毒素的载体菌株。结果表明：该菌对小鼠的半致死剂量LD50远大于5 000 mg/kg，筛选得到特异性引物，检测发现小鼠组织及血液、粪便中感染CSLH88，但未出现病变，且在21 d内可以完全清除。小鼠在试验期间未出现异常现象。嗜虫耶尔森氏菌对小鼠无毒性和致病性，可作为防治松墨天牛Monochamus alternatus的潜在工程菌株。

关键词：松墨天牛嗜虫耶尔森氏菌毒性致病性特异性引物设计

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基于DNA屏蔽和qPCR的乳酸菌菌株水平活菌计数研究

基于DNA屏蔽和qPCR的乳酸菌菌株水平活菌计数研究

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作者：虞星彤扬州大学

学位级别：硕士

由于益生菌的功能特性和生长特性具有菌株特异性,因此对同一物种中特定的某一菌株进行计数是至关重要的,同时也是现存的难题。本文对2株鼠李糖乳杆菌进行了基因家族分析,设计了特异性引物,利用qPCR技术,建立了一种高分辨能力(菌株水平)... 详细信息

由于益生菌的功能特性和生长特性具有菌株特异性,因此对同一物种中特定的某一菌株进行计数是至关重要的,同时也是现存的难题。本文对2株鼠李糖乳杆菌进行了基因家族分析,设计了特异性引物,利用qPCR技术,建立了一种高分辨能力(菌株水平)、低延时的选择计数方法,为动态监测混菌发酵体系中菌株的活性变化规律和混菌产品的活菌检测提供技术支持。具体研究内容如下:(1)菌株鉴定引物的设计及验证。本文对鼠李糖乳杆菌hsryfm1301和鼠李糖乳杆菌LV108进行全基因组测序,并以鼠李糖乳杆菌GG和鼠李糖乳杆菌Lc705为参考菌株进行基因家族分析。在鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301和鼠李糖乳杆菌LV108中分别发现了 31个和19个菌株特异性开放阅读框(ORF)。在菌株特异性ORF(及其相邻区域)内设计了多对引物,经验证菌株特异引物性对能够将鼠李糖乳杆菌LV108(引物对V2、V4、V5和V9)或鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301(引物对H1、H2、H3和H4)与其他12个鼠李糖乳杆菌菌株快速区分。(2)菌株计数引物的设计。本文在菌株鉴定引物扩增区内,分别为鼠李糖乳杆菌LV108和鼠李糖乳杆菌hsryfm1301设计了三对引物(L1、L2、L3和Y1、Y2、Y3)。根据扩增条带选择L2和Y3进行标准曲线绘制,通过构建标准品质粒pMD-L2和pMD-Y3,分别得出鼠李糖乳杆菌hsryfm 1301计数的标准曲线方程为:y=-3.3357x+44.983(R2=99.88%,e=0.986),鼠李糖乳杆菌LV108计数的标准曲线方程为:y=-3.411x+45.635(R2=99.95%,e=0.964)。L2引物对和Y3引物对对瑞士乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌,以及鼠李糖乳杆菌GG和HN001等干扰菌株没有扩增反应,具有较好的菌株特异性。(3)鼠李糖乳杆菌的菌株水平计数。本文优化了菌株计数过程中的DNA提取流程:取500μL菌悬液,收集菌体,采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA,180 μL 20 mg/mL的溶菌酶处理2 h后,继续使用20 μL 20 mg/mL蛋白酶K处理30 min,后续按照说明书进行。单菌培养时,qPCR法结果与OD600值具有一致性,由于qPCR法会同时检测死菌和非可培养菌体,在生长后期的计数结果大于平板计数法。混菌培养时,qPCR成功对体系中的菌株进行了计数,并发现了菌株间的拮抗作用。采用PMA屏蔽死亡菌体后,PMA-qPCR法与平板计数法得到的结果进一步接近。但在衰亡期时,PMA-qPCR法结果仍高于平板计数。总而言之,本文建立了一种菌株特异性鉴定引物的设计方法,实现了菌种内不同菌株的选择计数,使多菌株混合培养体系的菌株监测成为可能。

关键词：乳酸菌菌株级鉴定菌株级计数特异性引物设计 PMA-qPCR

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