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杨属派间5个种特异性InDel引物及在派间杂交子代鉴别中的应用

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林业科学 2024年第2期60卷 78-86页

作者：戴晓港韩峭子尹佟明林木遗传育种全国重点实验室、南方现代林业协同创新中心、林木遗传与生物技术教育部重点实验室、江苏省林木遗传和高效培育重点实验室、南京林业大学林学院南京210037

【目的】远缘杂交可以实现有利基因的聚合,是种质创新的重要手段。杨属有些派间杂交困难,且杂交子代从形态学难以区分,本研究开发杨属不同派间的特异性引物,为派间杂交创制新种质的真实性鉴定提供技术支撑。【方法】利用在美洲黑杨和小... 详细信息

【目的】远缘杂交可以实现有利基因的聚合,是种质创新的重要手段。杨属有些派间杂交困难,且杂交子代从形态学难以区分,本研究开发杨属不同派间的特异性引物,为派间杂交创制新种质的真实性鉴定提供技术支撑。【方法】利用在美洲黑杨和小叶杨中种特异性InDel位点设计引物,并利用SeqHunter2依次比对胡杨、山杨、小叶杨和大叶杨基因组,再用杨属5个派的自然群体材料进行种内保守及种间多态引物的试验验证,筛选出杨属不同派的特异性引物序列,对杨属不同派间杂交子代进行真实性鉴别。【结果】将从美洲黑杨基因组设计的5000对InDel引物依次分别比对胡杨、山杨、小叶杨和大叶杨基因组,最后筛选出341对引物在上述5个种中是通用的。从不同染色体上共选取48对引物并合成,利用5个树种各1个DNA检测得到43对引物是通用的,其中19对引物在不同种中扩增条带单一且存在差异。利用自然群体混合DNA对试验验证的19对通用引物进行种间多态性和种内保守性检测,初步获得4对多态性引物。最后再用自然群体DNA对这4对引物进行扩增检测,发现引物Chr12_4341229和Chr13_10582756在美洲黑杨、小叶杨、山杨、大叶杨和胡杨中均只能扩增出一个位点,引物Chr12_4341229扩增条带分别为148、152、113、152和159 bp,引物Chr13_10582756扩增条带分别为140、144、116、140和159 bp。利用上述2对引物对小胡杨2号、黑胡杨和黑小杨进行鉴定,发现所有杂交子代个体均能检测它们2个亲本的特征带。引物Chr12_4341229和Chr13_10582756一起使用,可以用于美洲黑杨、小叶杨、山杨、大叶杨和胡杨任意组合杂交子代的真实性鉴别。【结论】本研究获得了杨属5个派间的5个种的特异性InDel引物2对,可以有效地进行杨属不同派5个种之间任意组合种间杂交子代的真实性鉴别,为进一步开展杨树派间杂交创制新种质提供了技术支持。

关键词：杨属远缘杂交物种特异性引物种间杂交分子鉴别

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基于物种特异性InDel标记鉴别美洲黑杨与小叶杨的杂交子代

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林业科学 2021年第11期57卷 79-84页

作者：戴晓港陈晨薛良交吴怀通尹佟明江苏省杨树种质创新与品种改良重点实验室南京林业大学南京210037

【目的】针对杨树种间杂交子代苗期形态不易区分的问题,利用美洲黑杨和小叶杨物种特异性InDel位点开发标记对种间杂交子代进行快速鉴别,为黑杨派和青杨派种间杂交子代鉴定、分子标记辅助育种等研究提供重要的参考技术。【方法】以美洲... 详细信息

【目的】针对杨树种间杂交子代苗期形态不易区分的问题,利用美洲黑杨和小叶杨物种特异性InDel位点开发标记对种间杂交子代进行快速鉴别,为黑杨派和青杨派种间杂交子代鉴定、分子标记辅助育种等研究提供重要的参考技术。【方法】以美洲黑杨、小叶杨及其杂交子代为试验材料,根据美洲黑杨和小叶杨重测序结果分析物种特异性InDel位点并设计引物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物进行通用性和物种特异性检测,用筛选出的物种特异的引物,对种间杂交子代的真实性进行鉴别。【结果】分别将10个个体的美洲黑杨和小叶杨重测序序列比对到美洲黑杨基因组,共获得长度差异大于5 bp的InDel位点359733个,其中种内特异、种间存在差异的InDel位点18418个。采用Primer3在美洲黑杨基因组中的17956个位点成功设计引物。在不同染色体共选取10对引物,采用SeqHunter2将引物序列比对到小叶杨基因组,共有6对引物在小叶杨中是通用的。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,发现引物Psi2-1和Psi13-14在美洲黑杨和小叶杨中存在差异。利用美洲黑杨和小叶杨自然群体各50个个体对上述2个引物进行检测,发现引物Psi2-1在美洲黑杨中扩增出128 bp的特异性产物,在小叶杨中扩增出139 bp的特异性产物,在真实的种间杂交子代中扩增出128 bp和139 bp 2条产物;引物Psi13-14在美洲黑杨中扩增出132 bp的特异性产物,在小叶杨中扩增出144 bp的特异性产物,在真实的种间杂交子代中扩增出132 bp和144 bp 2条产物。2对引物对美洲黑杨与小叶杨种间杂交子代鉴别准确率达100%。【结论】获得了美洲黑杨和小叶杨物种特异性InDel标记2对,上述标记可以有效地用于美洲黑杨与小叶杨种间杂交子代的真实性鉴别。

关键词：美洲黑杨小叶杨种间杂交物种特异性引物分子鉴别

新疆棉花蚜虫-寄生蜂食物网结构的分子检测体系

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植物保护学报 2021年第5期48卷 970-979页

作者：李金花李海强杨帆吴月坤张建萍陆宴辉中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 海南大学植物保护学院热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室海口570228 新疆农业科学院植物保护研究所乌鲁木齐830091 北京市农业科学院植物保护环境保护研究所北方果树病虫害绿色防控北京市重点实验室北京100097 石河子大学农学院新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室石河子832003

为明确新疆棉花蚜虫-寄生蜂的食物网结构,通过设计新疆棉花蚜虫和寄生蜂的特异性引物,建立并优化可以在物种水平上开展棉花蚜虫-寄生蜂食物网结构分析的分子检测方法,该方法包括3个多重PCR检测体系(cMP1、cPriMP2和cHypMP3)和1个单一PCR... 详细信息

为明确新疆棉花蚜虫-寄生蜂的食物网结构,通过设计新疆棉花蚜虫和寄生蜂的特异性引物,建立并优化可以在物种水平上开展棉花蚜虫-寄生蜂食物网结构分析的分子检测方法,该方法包括3个多重PCR检测体系(cMP1、cPriMP2和cHypMP3)和1个单一PCR(cSP1)检测体系,并应用建立的方法对采自库尔勒、阿克苏、昌吉的2383头僵蚜样品进行分子检测。结果表明,4个体系的灵敏度均较高,其中蚜虫cMP1体系的检出限为500 DNA拷贝数,初级寄生蜂cPriMP2体系的检出限为5000 DNA拷贝数,重寄生蜂cHypMP3和cSP1体系的DNA检出限分别为500拷贝数和100拷贝数。该方法能够快速且准确地鉴定4种棉花蚜虫、4种初级寄生蜂和7种重寄生蜂,特异性良好。使用该方法对供试僵蚜样品进行检测并成功绘制出新疆棉花蚜虫-初级寄生蜂-重寄生蜂食物网,定量分析了不同初级寄生蜂对蚜虫的寄生作用及重寄生蜂与初级寄生蜂之间形成的食物网络关系。表明所建立的分子检测方法可以用于评估不同种类寄生蜂在新疆棉花蚜虫种群控制中的生态功能,解析物种间的食物网关系。

关键词：蚜虫-初级寄生蜂-重寄生蜂食物网物种特异性引物分子检测多重PCR

基于基因组特异性SSR序列的实蝇PCR鉴定方法

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应用昆虫学报 2018年第4期55卷 759-765页

作者：丁思敏王书平贺康李飞蒋明星浙江大学昆虫科学研究所杭州310058 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心上海200135

【目的】实蝇科昆虫是全球范围内重要的检疫性害虫,其幼虫取食寄主果实,引起果实腐烂、变质,造成巨大经济损失。由于口岸截获多为实蝇卵、幼虫、蛹等非成虫虫态,需饲养至成虫才能根据形态准确鉴定,因此快速可靠的分子鉴定技术体系亟需... 详细信息

【目的】实蝇科昆虫是全球范围内重要的检疫性害虫,其幼虫取食寄主果实,引起果实腐烂、变质,造成巨大经济损失。由于口岸截获多为实蝇卵、幼虫、蛹等非成虫虫态,需饲养至成虫才能根据形态准确鉴定,因此快速可靠的分子鉴定技术体系亟需完善。【方法】利用公开发表的实蝇基因组序列,通过生物信息学方法从4种检疫性实蝇即地中海实蝇Ceratitis capitata、瓜实蝇Bactrocera cucurbitae、橘小实蝇Bactrocera dorsalis、昆士兰实蝇Bactrocera tryoni中挖掘物种特异性的简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR),针对各物种设计含有其特异性简单重复序列的引物,提取实蝇样品基因组DNA,采用常规PCR方法优化并筛选各物种特异性引物。【结果】在4种实蝇基因组中共发现20条物种特异性的SSR,基于这些序列设计的3对特异性引物能有效区分地中海实蝇、瓜实蝇和橘小实蝇,扩增片段大小分别为1 251、1 307、823 bp,而在其他物种中检测不到条带。【结论】基因组水平的序列分析发现了物种特异性的SSR,通过筛选获得物种特异性的PCR引物,可应用于3种实蝇的分子鉴定,为口岸检疫人员快速鉴定区分非成虫状态的实蝇提供了实用性技术。

关键词：实蝇简单重复序列物种特异性引物 PCR 检疫

物种特异性PCR在中药材白花蛇舌草鉴定中的应用(英文)

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南京师大学报（自然科学版） 2006年第3期29卷 91-94页

作者：刘忠权丁小余丁秉中江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室盐城师范学院生物系江苏盐城224002 南京师范大学生命科学学院江苏南京210097

提供中药材白花蛇舌草物种特异性鉴定引物以及建立简便、高效的特异性鉴定方法和研制鉴定试剂盒.为此收集目前市场上出现的所有白花蛇舌草正伪品样品共9种,并测定所有样品的核糖体基因ITS区核苷酸序列,在此基础上设计一对物种特异性引物... 详细信息

提供中药材白花蛇舌草物种特异性鉴定引物以及建立简便、高效的特异性鉴定方法和研制鉴定试剂盒.为此收集目前市场上出现的所有白花蛇舌草正伪品样品共9种,并测定所有样品的核糖体基因ITS区核苷酸序列,在此基础上设计一对物种特异性引物B174和B53,特异性地鉴定白花蛇舌草.表明用这对引物扩增白花蛇舌草,获得207 bp的特异性产物,而其它伪混品样品没有阳性产物.可以认为用白花蛇舌草特异性鉴定引物B174和B53的所配制的鉴定试剂盒具有很好的应用前景.

关键词：白花蛇舌草物种特异性引物鉴定

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基于线粒体DNA序列的鹿产品分子检测

基于线粒体DNA序列的鹿产品分子检测

作者：査代明江苏科技大学

学位级别：硕士

在我国,鹿产品大多为名贵中药材,且我国历代本草和现代药典均把梅花鹿或马鹿的产品列为正品。由于鹿产品价格昂贵,市场上屡见用伪劣产品来冒充名贵的鹿产品,因此对鹿产品进行质量检测非常有意义。目前,利用mtDNA序列检测鹿产品的方法大... 详细信息

在我国,鹿产品大多为名贵中药材,且我国历代本草和现代药典均把梅花鹿或马鹿的产品列为正品。由于鹿产品价格昂贵,市场上屡见用伪劣产品来冒充名贵的鹿产品,因此对鹿产品进行质量检测非常有意义。目前,利用mtDNA序列检测鹿产品的方法大多为PCR-RFLP法、序列分析法和物种特异性PCR法,虽然这些方法能够有效地应用于鹿产品的检测,但是由于冒充鹿产品的动物源性成分较多,利用这些方法来检测鹿产品显得有些复杂且周期较长,因此有必要设计一套更加简单、快捷的方法。本文首先对抗凝血基因组DNA的提取方法进行了改进,并且对传统酚-氯仿法也做了修改。改进后的抗凝血基因组DNA提取法具有无毒、成本低、产率较高、操作简单、整个过程不到1 h等优点;修改后的酚-氯仿法更适合于微量鹿产品的基因组DNA提取。其次,利用GenBank数据库中鹿科动物线粒体全基因组序列,设计了可覆盖鹿科动物线粒体基因组序列的引物,利用这些引物对东北梅花鹿、东北马鹿和塔里木马鹿的线粒体进行了全基因组测序,并将注释完全的序列提交到GenBank数据库,同时对这些序列进行了分析,最后联合GenBank数据库中的鹿科动物线粒体全基因组序列,Clustal X 1.83软件序列比对后,利用MEGA 4.0软件对梅花鹿、马鹿和赤鹿进行了系统进化分析。结果表明:梅花鹿存在3个明显的支系,即中国种群(大陆和台湾)、日本南部种群和日本北部种群,且大陆梅花鹿与日本南部梅花鹿的亲缘关系更近,日本梅花鹿分化为南、北两个种群,至少通过两个大陆桥在晚更新世从亚洲大陆迁徙至日本,台湾梅花鹿可能已达到了种的水平;Cervus elaphus起源于中亚,向东、西两个方向分化,形成了两个不同的物种即马鹿(亚洲-北美种群)和赤鹿(欧洲种群),马鹿与梅花鹿的亲缘关系更近,塔里木马鹿是赤鹿的祖先;梅花鹿和马鹿有最近的共同祖先,与赤鹿的祖先在中亚地区分别向东、西两个方向迁徙进化,最终向东分化为梅花鹿和马鹿,向西分化为赤鹿。最后,利用本文测定的线粒体全基因组序列以及GenBank数据库中的鹿科动物、猪、牛、羊线粒体全基因组序列,采用Bioedit 7.***.9.0软件进行序列比对,根据种内具有保守性、种间具有特异性的原则选择合适的区域,利用Oligo 6.0软件设计物种特异性引物。结果设计出了梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿、驯鹿和牛特异性引物,并联合文献中的猪、羊、鸡特异性引物,建立了两套Multiplex PCR方法,能够从鹿科动物和常见家养动物两个方面对各类鹿产品进行检测,达到了稳定、可靠、周期短、成本低廉的效果;设计出了水鹿特异性引物,建立了水鹿特异性PCR方法,能够对水鹿进行特异性检测。

关键词：鹿科鹿产品分子检测 mtDNA序列物种特异性引物 Multiplex PCR

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DNA技术鉴定动物物种研究评述

通化师范学院学报 2008年第2期29卷 48-51页

作者：周用武国家林业局野生动植物刑事物证鉴定中心

文中对DNA技术用于动物物种鉴定常用的限制性片段多态(RFLP)、随机扩增片段长度多态(RAPD)、扩增片段长度多态(AFLP)、扩增片段限制性长度多态(PCR-RFLP)、物种特异性引物扩增和直接测序法等6种方法进行了介绍,并对其研究状况和方法的... 详细信息

文中对DNA技术用于动物物种鉴定常用的限制性片段多态(RFLP)、随机扩增片段长度多态(RAPD)、扩增片段长度多态(AFLP)、扩增片段限制性长度多态(PCR-RFLP)、物种特异性引物扩增和直接测序法等6种方法进行了介绍,并对其研究状况和方法的优缺点进行了评述,指出了DNA技术用于动物物种鉴定存在的问题及发展方向.

关键词： DNA技术动物物种鉴定片段长度多态 PCR扩增物种特异性引物