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牡丹叶霉病菌LAMP检测方法的建立及防治药剂筛选研究

牡丹叶霉病菌LAMP检测方法的建立及防治药剂筛选研究

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作者：柴秋源河南科技大学

学位级别：硕士

叶霉病是牡丹上发病最严重的病害之一,常造成牡丹生长势减弱、花色衰退、牡丹籽油产量减少等,严重影响牡丹产业的快速发展。植物病害的早期诊断对于实施综合防治具有重要意义,因此,建立一种叶霉病菌(Cladosporium paeoniae)的快速检测方... 详细信息

叶霉病是牡丹上发病最严重的病害之一,常造成牡丹生长势减弱、花色衰退、牡丹籽油产量减少等,严重影响牡丹产业的快速发展。植物病害的早期诊断对于实施综合防治具有重要意义,因此,建立一种叶霉病菌(Cladosporium paeoniae)的快速检测方法,实现病害发生初期的早发现、早诊断,对于牡丹叶霉病的治理具有重要意义。本文以牡丹叶霉病菌的内转录间隔区(ITS)为靶标序列,建立能够快速、简单鉴定牡丹叶霉病菌的环介导等温扩增(LAMP)方法;通过涂布平板法和菌丝生长速率法开展7种杀菌剂对病菌生长发育各阶段的抑制活性,进一步采用喷雾法测定药剂对牡丹叶霉病的田间防效,为牡丹叶霉病的综合防治提供备选药剂。以牡丹叶霉病菌ITS序列中的特异性片段作为目的序列,设计出三组特异性引物,使用其中的一组F1/B1、FIP/BIP进行后续试验。建立的LAMP反应体系,能够特异性检测牡丹叶霉病菌。优化反应体系各个组分后,建立的叶霉病菌的LAMP反应检测最终体系(25μL)为:2.5μL 10×Thermo Pol Buffer、0.16 U/μL Bst DNA聚合酶、1 mmol/L d NTP、8 mmol/L Mg SO、0.2μmol/L F3/B3、0.6mol/L甜菜碱、1.6μmol/L FIP/BIP、0.15 mmol/L HNB、1μL模板DNA,dd HO补至25μL。反应温度设置为64℃,反应总时间是60 min。且该检测体系具有较高的灵敏度,可以检测到的DNA最低限度为1 pg,比普通PCR灵敏100倍。对于田间疑似病叶的检测中,LAMP检测结果与室内镜检结果相一致,表明本试验建立的LAMP体系具有较高的准确率。本LAMP检测体系可用于牡丹叶霉病的早期检测以及病害监测预警。室内进行7种杀菌剂对牡丹叶霉病菌生长的抑制作用。结果表明:7种杀菌剂对牡丹叶霉病菌四个发育阶段均有一定的抑制作用,但对病菌的抑制效果存在差异。咪鲜胺和氟唑菌酰羟胺对叶霉病菌的四个生长发育阶段均有极强的抑制作用,咪鲜胺对孢子萌发、芽管伸长、菌丝生长和产孢的EC分别为0.0176、0.0083、0.0756和0.0121μg/m L,氟唑菌酰羟胺对孢子萌发、芽管伸长、菌丝生长和产孢的EC分别为0.1134、0.0047、0.6990和0.0172μg/m L;氟啶胺对病菌芽管伸长和产孢的抑制作用较强,EC分别为0.0106、0.0183μg/m L,但对病菌的孢子萌发和菌丝生长阶段没有很好的抑制作用;戊唑醇对菌丝生长和产孢的抑制作用较强,EC分别为0.3166、0.0277μg/m L,但对其他阶段的抑制作用较差。氟吡菌酰胺、丙硫菌唑和异菌脲对叶霉病菌生长发育的四个阶段的抑制作用均较差。田间试验结果表明,7种药剂各浓度处理均对叶霉病有很好的田间防效,病情指数显著降低,其中氟唑菌酰羟胺对牡丹叶霉病的防治效果最好,对A地的防效均在50%以上,70 g/亩氟唑菌酰羟胺处理后对叶霉病的防效达到90.86%;戊唑醇对叶霉病的防治效果较好,8 g/亩和10 g/亩处理对叶霉病的防治效果也均在50%以上;咪鲜胺的防治效果也较好,各浓度处理下防效均大于45%。其他药剂对叶霉病均有一定的防治效果,且各药剂处理对牡丹叶片均无明显的损伤现象,说明药剂对牡丹叶片是安全的。

关键词：牡丹叶霉病牡丹叶霉病菌环介导等温扩增(LAMP) 毒力测定杀菌剂病害防治

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