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作者：裴娜吉林大学

学位级别：硕士

颗粒细胞作为卵泡内最大的体细胞群,在卵泡的生长发育、卵母细胞成熟以及排卵过程发挥重要作用。生长停滞特异性因子1(GAS1)可调控细胞增殖和分化,并潜在调节哺乳动物的卵巢功能及胚胎发育。课题组前期研究也发现,GAS1潜在影响牛颗粒细... 详细信息

颗粒细胞作为卵泡内最大的体细胞群,在卵泡的生长发育、卵母细胞成熟以及排卵过程发挥重要作用。生长停滞特异性因子1(GAS1)可调控细胞增殖和分化,并潜在调节哺乳动物的卵巢功能及胚胎发育。课题组前期研究也发现,GAS1潜在影响牛颗粒细胞凋亡、老化及类固醇激素分泌,然而,其具体作用和机制尚不明确,为此,本论文开展了以下几方面研究:***1介导的牛颗粒细胞基因表达谱的构建。为了探究GAS1对牛颗粒细胞基因表达的影响,采用GAS1特异性si RNA(si-GAS1)敲降颗粒细胞中GAS1的表达,并通过转录组学测序构建差异基因表达谱,分析GAS1对牛颗粒细胞的作用及关键生物学通路。结果显示,与对照组相比,si-GAS1组存在差异表达基因571个,其中有246个基因上调,325个基因下调。GO富集分析结果显示,差异表达基因与细胞代谢、氧化应激、线粒体外膜通透性、ATP代谢等754个生物学过程相关。KEGG富集分析结果显示,差异表达基因主要涉及PI3K-AKT、MAPK、胆固醇代谢等267条通路。2.抑制GAS1促进牛颗粒细胞增殖并抑制其凋亡。利用si-GAS1抑制GAS1表达,通过Ed U染色法和CCK-8细胞活力检测法检测细胞增殖变化;通过qRT-PCR检测细胞增殖相关基因PCNA、CCND2和CDC42的m RNA表达水平的变化。结果表明,抑制GAS1后,牛颗粒细胞的增殖比例和细胞活力均显著上升,细胞增殖比例为对照组的2.92±0.46倍(P细胞活力为对照组的1.38±0.09倍(P牛颗粒细胞凋亡的影响,利用si-GAS1抑制GAS1表达,通过Annexin V-FITC染色结合流式细胞术检测细胞凋亡水平变化;通过qRTPCR检测细胞凋亡相关基因Bax/Bcl2和caspase-3 m RNA表达水平变化。结果表明,抑制GAS1后,牛颗粒细胞凋亡水平显著降低为对照组的0.52±0.06倍(P牛颗粒细胞孕酮合成、促进雌二醇合成。利用si-GAS1抑制GAS1表达,ELISA法检测孕酮及雌二醇水平变化,qRT-PCR以及Western blot分别检测孕酮合成关键基因St AR、HSD3B1及雌二醇合成关键基因CYP19A1的m RNA和蛋白表达水平。结果表明,抑制GAS1后,孕酮合成水平显著降低为对照组的0.67±0.14倍(P牛颗粒细胞线粒体功能。利用si-GAS1抑制GAS1表达,通过检测ATP水平探究线粒体能量产生变化;通过检测线粒体动力学以及线粒体自噬蛋白MFN1、MFN2、DRP1和Parkin表达水平探究GAS1对线粒体稳态的影响;通过ROS染色及酶标仪检测法,探究细胞ROS水平变化。结果表明,抑制GAS1后,线粒体ATP水平显著上升为对照组的1.17±0.02倍(P细胞ROS水平显著降低。5.抑制GAS1能够激活PI3K-AKT信号通路。为了探究GAS1对牛颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌的潜在机制,利用si-GAS1抑制GAS1表达,并进一步检测调节细胞增殖、凋亡及内分泌功能的关键通路PI3K-AKT信号通路的激活变化,结果表明,抑制GAS1后PI3K的水平及AKT的磷酸化水平显著上升。综上所述,GAS1可通过调控PI3K-AKT信号通路及线粒体功能进而影响牛颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌水平。研究结果为进一步研究牛卵泡发育的分子调控机制提供理论依据。

关键词： GAS1 牛颗粒细胞增殖凋亡孕酮雌激素

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姜黄素通过类铜死亡机制影响牛颗粒细胞类固醇激素的合成

姜黄素通过类铜死亡机制影响牛颗粒细胞类固醇激素的合成

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作者：徐玲霞吉林大学

学位级别：硕士

姜黄素作为饲料添加剂,因其抗炎、抗氧化、促生长等特性,被广泛应用于畜牧生产中,以达到改善肉品质、增加产肉量的目的。但也有研究表明,姜黄素因其具有酮烯醇式结构能与铜离子结合,并导致细胞内铜积累,进而引起雄性动物精子质量和雌性... 详细信息

姜黄素作为饲料添加剂,因其抗炎、抗氧化、促生长等特性,被广泛应用于畜牧生产中,以达到改善肉品质、增加产肉量的目的。但也有研究表明,姜黄素因其具有酮烯醇式结构能与铜离子结合,并导致细胞内铜积累,进而引起雄性动物精子质量和雌性动物卵巢机能下降,尤其是激素的合成及卵子质量,具有潜在的生殖毒性,且此过程中呈现的部分生物学表型与最新发现的线粒体调控机制——“铜死亡”十分类似。然而,姜黄素的生殖毒性是否与铜离子有关,与铜死亡调控机制有何异同尚不明确。颗粒细胞是卵巢中雌激素及孕酮合成的主要来源。本研究首先通过外源性添加20μM姜黄素及四种细胞特异性细胞死亡抑制剂（凋亡抑制剂:Z-VAD-FMK;坏死抑制剂:Necrostain-1;铁死亡抑制剂:Ferrostain-1;铜死亡抑制剂:TTM）来探究姜黄素对颗粒细胞的影响。相关结果表明,20μM姜黄素可以显著下调牛颗粒细胞活力,且仅铜死亡抑制剂TTM能缓解姜黄素引起的牛颗粒细胞活力下降。为进一步探究20μM姜黄素对牛颗粒细胞的调控机制与铜死亡的关系,选取2.5μM Cu SO4+10 n M伊利司莫（ES）构建牛颗粒细胞铜死亡模型。利用用ICP-MS质谱法和细胞铜荧光染色检测细胞内铜含量的变化并利用Western blot法检测姜黄素组（Cur）和铜死亡组（Cu-ES）中铜死亡关键蛋白和铜转运蛋白的表达变化。结果表明,Cur组和Cu-ES组细胞内铜含量均显著增加（p牛颗粒细胞内铜积累,引发类铜死亡。随后,为探究20μM姜黄素对类固醇激素合成的影响,利用Western blot检测类固醇激素合成关键蛋白St AR、CYP11A1、HSD3B1和CYP19A1的表达水平,并通过ELISA法检测了培养液中的雌二醇（E2）和孕酮（P4）含量。结果显示,与NC组相比,E2合成调控蛋白CYP19A1和P4合成调控蛋白St AR、CYP11A1、HSD3B1表达水平均显著下降（p牛颗粒细胞E2和P4的合成。为进一步探讨姜黄素介导的类铜死亡对牛颗粒细胞类固醇激素合成的调控机制并比较其与铜死亡的异同,本研究通过高通量测序,构建了姜黄素和铜死亡介导的牛颗粒细胞基因表达谱。相关结果表明,与NC组相比,Cur组存在差异表达基因（DEG）9718个,Cu-ES组存在DEGs 1635个,其中有1059个DEGs同时存在于Cur组和Cu-ES组。对这1059个DEGs进行GO和KEGG富集分析表明,DEGs主要涉及线粒体ATP合成与蛋白质转运的调控、胆固醇生物合成、雌激素和AMPK信号通路等生物学过程及通路,研究结果明确了姜黄素与铜死亡对牛颗粒细胞基因表达影响的异同。在明确姜黄素与铜死亡处理均潜在影响线粒体功能后,本研究通过荧光染料染色、免疫荧光、Western blot等方法,检测了线粒体膜电位（MMP）、ROS、线粒体氧化磷酸化、ATP水平以及线粒体动力学相关蛋白的表达水平。结果显示,与NC组相比,Cur组和Cu-ES组MMP水平均显著下降,ROS水平显著升高。线粒体氧化磷酸化过程中的复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ蛋白表达水平显著降低,ATP水平也显著下降（p粒细胞内胆固醇的合成至关重要。为明确牛颗粒细胞内胆固醇的合成是否受到姜黄素和铜死亡调控机制的影响,本研究利用荧光染色等方法检测了细胞内脂滴、总胆固醇含量以及胆固醇合成原料乙酰辅酶A的水平;利用Western blot检测了胆固醇合成关键蛋白HMGCR表达及AMPK通路激活水平。结果表明,与NC组相比,Cur组和Cu-ES组细胞内脂滴

关键词：姜黄素牛颗粒细胞铜死亡线粒体类固醇激素

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β-巯基乙醇和发情羊血清对牛颗粒细胞体外培养的影响

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西北农业学报 2011年第12期20卷 22-25页

作者：权富生刘琴王丽君马会明王勇胜张涌西北农林科技大学动物医学学院农业部动物生殖生理与胚胎工程重点开放实验室陕西杨凌712100

为满足实验室卵母细胞体外成熟共培养和胚胎共培养的需要以及进行卵巢颗粒细胞生物学功能等研究的需要,进行牛卵巢颗粒细胞的体外培养研究。在基础培养液TCM199中分别添加12.5、25、50、100、200μmol/L的β-巯基乙醇(BME),观察颗粒细... 详细信息

为满足实验室卵母细胞体外成熟共培养和胚胎共培养的需要以及进行卵巢颗粒细胞生物学功能等研究的需要,进行牛卵巢颗粒细胞的体外培养研究。在基础培养液TCM199中分别添加12.5、25、50、100、200μmol/L的β-巯基乙醇(BME),观察颗粒细胞生长状况;在基础培养液中分别添加体积分数为10%的发情山羊第1天血清、体积分数为10%的发情山羊第11天血清和体积分数为10%的胎牛血清,观察颗粒细胞生长和增殖情况。体外培养颗粒细胞的活细胞率随着添加BME浓度的增大而增加,在25μmol/L时达到最高,此后随浓度的增大而降低;发情山羊第1天的血清组中,颗粒细胞生长和增殖情况最好。BME可以提高颗粒细胞体外培养的活率,最佳添加浓度为25μmol/L;发情山羊第1天的血清可有效促进颗粒细胞体外培养生长和增殖。

关键词： β-巯基乙醇发情山羊血清牛颗粒细胞体外培养

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