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黑龙江畜牧兽医 2023年第9期 73-79页

作者：吴翠兰禤雄标李军彭昊陶立李常挺兰美益贺会利冯世文钟舒红马春霞白慧丽李小宁胡帅广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室南宁530001

为了了解广西地区奶牛、肉牛的牛库布病毒(bovine Kobuvirus, BKV)感染情况及分子特征,试验采用RT-PCR的方法对从广西地区采集的奶牛粪便177份、肉牛粪便27份(共204份粪便,其中腹泻牛粪便82份,健康牛粪便122份)进行BKV和其他肠道病毒的... 详细信息

为了了解广西地区奶牛、肉牛的牛库布病毒(bovine Kobuvirus, BKV)感染情况及分子特征,试验采用RT-PCR的方法对从广西地区采集的奶牛粪便177份、肉牛粪便27份(共204份粪便,其中腹泻牛粪便82份,健康牛粪便122份)进行BKV和其他肠道病毒的检测,分析BKV与其他肠道病毒的共感染情况,以及不同地点和不同季节BKV的感染情况,同时对广西地区BKV的3D基因与国内外30株库布病毒的3D基因进行核苷酸序列同源性分析和遗传进化分析。结果表明:广西地区BKV的感染率为2.94%(6/204),均从腹泻牛粪便中检出,其中奶牛和肉牛的感染率分别为2.26%(4/177)、7.41%(2/27),将6株毒株分别命名为BKV-GXGG01(贵港株)、BKV-GXHC01(河池株)、BKV-GXHC02(河池株)、BKV-GXNN01(南宁株)、BKV-GXNN02(南宁株)和BKV-GXNN03(南宁株);BKV与牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒和牛星状病毒存在混合感染,感染率为66.67%(4/6),而单一感染率为33.33%(2/6);6株广西地区BKV毒株的3D基因间的核苷酸序列同源性为93.5%~100%,与国内外Aichivirus B类型参考毒株间的核苷酸序列同源性为89.9%~95.1%,与其他库布病毒参考毒株的核苷酸同源性为35.9%~75.2%;6株广西地区毒株在遗传进化分析中均属于Aichivirus B类型,毒株BKV-GXNN01与日本株K-35、河南株B4、内蒙古株H6和H18、山东株C2、黑龙江株SC7-5、辽宁株H9同属一分支,其余5株毒株BKV-GXGG01、BKV-GXHC01、BKV-GXHC02、BKV-GXNN02、 BKV-GXNN03与北京株B1213、泰国株CMB02、日本株U-1同属一分支。说明在广西地区奶牛、肉牛的腹泻病例中均存在BKV感染,推测BKV可能与牛腹泻有关。

关键词：广西地区牛库布病毒腹泻 3D序列共感染

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实时荧光定量RT-PCR检测牛库布病毒

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畜牧兽医学报 2020年第4期51卷 888-893页

作者：李慧平汤承岳华西南民族大学生命科学与技术学院成都610041 国家现代农业产业技术体系四川省兽药创新团队成都610041

牛库布病毒(bovine kobuvirus,BKoV)可能是一个腹泻相关病原,目前还没有检测该病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的报道。依据BKoV 3D核苷酸序列,采用Primer 6.0设计了一对引物,通过优化反应条件和反应体系,成功建立了检测BKoV的TB Green染... 详细信息

牛库布病毒(bovine kobuvirus,BKoV)可能是一个腹泻相关病原,目前还没有检测该病毒的实时荧光定量RT-PCR方法的报道。依据BKoV 3D核苷酸序列,采用Primer 6.0设计了一对引物,通过优化反应条件和反应体系,成功建立了检测BKoV的TB Green染料法实时荧光定量RT-PCR方法。结果显示此方法在4.86×10^8~4.86×10^2 copies·μL^-1病毒浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.9995,扩增效率为92.75%;此方法只特异性检测BKoV,而与其他常见的腹泻病原没有交叉反应;组内及组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为4.86×10^2 copies·μL^-1。本研究所建的实时荧光定量RT-PCR方法对奶牛和牦牛腹泻粪便样本中BKoV的检出率明显高于已报道的3篇有关RT-PCR方法。对2018年5月—2019年5月采集自青藏高原地区(青海、西藏和四川藏区)的131份牦牛腹泻粪便样本进行检测,结果显示BKoV检出率为31.30%。首次成功建立了检测BKoV的实时荧光定量RT-PCR方法,具有良好的特异性和稳定性,且灵敏度高,为BKoV的检测及流行病学调查提供了一种新的技术手段;并且首次证实BKoV在牦牛中的流行,为牦牛腹泻的防控问题提供了参考。

关键词：牛库布病毒实时荧光定量RT-PCR 牦牛腹泻

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我国部分省牛库布病毒的检测及基因组研究

我国部分省牛库布病毒的检测及基因组研究

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作者：李慧平西南民族大学

学位级别：硕士

牛库布病毒(Bovine kobuvirus,BKV)属于小RNA核酸病毒科,库布病毒属,为无囊膜,单股正链RNA病毒。其直径在30 nm-40 nm之间,呈球形。目前GenBank数据库中有3条BKV基因组,分别来自日本,英国和埃及。研究数据表明BKV可能与牛腹泻有关,但是... 详细信息

牛库布病毒(Bovine kobuvirus,BKV)属于小RNA核酸病毒科,库布病毒属,为无囊膜,单股正链RNA病毒。其直径在30 nm-40 nm之间,呈球形。目前GenBank数据库中有3条BKV基因组,分别来自日本,英国和埃及。研究数据表明BKV可能与牛腹泻有关,但是该病毒的致病性仍然还不清楚。自2003年BKV在日本被发现以来,该病毒已在10个国家被检测到,证明BKV有十分广泛的地域分布。BKV在奶牛中最高感染率可达77.8%,在肉牛中感染率为14%。2003年我国在奶牛腹泻粪便中首次发现BKV,经检测感染率高达34.9%。BKV的流行可能给我国的养牛行业的健康发展带来潜在的威胁。另外,牦牛作为我国青藏高原地区主要的牛种,还未见有关牦牛源BKV的报道。BKV作为一个新病毒,在我国的相关研究资料非常少。本研究主要对我国部分省份奶牛粪便样本进行分子检测,了解该病毒与奶牛腹泻的相关性及分子特征;了解青藏高原地区牦牛BKV的感染情况。取得的成果如下:1.完成了中国四个省区奶牛源BKV的分子检测和遗传进化分析为了了解我国部分省份犊奶牛的BKV的感染情况及分子特征。本研究样本收集自2018年1-4月份,分别来自于辽宁(3个奶牛场)、河南(3个奶牛场)、山东(3个奶牛场)、山西(5个奶牛场)4个省份的14个奶牛场共173份犊牛粪便样本(96份奶牛腹泻样本和77份奶牛非腹泻样本)。均来自2天-4月龄以内的犊牛。依据Jeoung H Y et al.报道的检测BKV RT-PCR方法进行检测。并以检测结果为阳性的样本核酸为模板,分别进行3D部分基因片段(552bp),完整VP1基因(801bp),VP0部分基因片段(660bp)进行扩增和分析。结果显示,173份粪便样本的阳性率为24.86%,奶牛场为64.29%,其中从96份腹泻样本中检测到34份BKV阳性(35.42%),从77份非腹泻样本中检测到的9份BKV阳性(11.69%)。奶牛腹泻粪样本BKV检出率显著高于非腹泻粪样的检出率(p库中登陆的其它3D序列相比,它们具有88.6%-96.4%的核苷酸序列同源性及其编码氨基酸序列同源性为92.4%-100%。进一步分析BKV 3D序列可分为两大支,本研究获得的毒株均分布在第一大支上,进一步又可以划分为10小支。另外本研究得到的15个完整的BKV VP1序列之间核苷酸同源性为74.2%-100.0%,推导的氨基酸同源性为80.1%-100.0%,与GenBank数据库中其它BKV VP1序列核苷酸序列同源性为72.9%-94.9%,推导的氨基酸同源性为80.5%-97.8%。进一步分析BKV VP1共分为8个谱系。本研究得到的7/15条序列分布在已知的谱系2上,其余的8/15条序列独立的集为3个新的分支,区别于已知的5个谱系。此外本研究获得的12个VP0部分基因片段序列之间具有78.5%-100%核苷酸序列同源性,推导氨基酸序列同源性84.1%-100%。与GenBank数据库中BKV VP0相比,具有80.2%-84.7%核苷酸序列同源性,推导的氨基酸序列同源性为85.0%-91.8%。进一步分析BKV VP0分为两个分支,本研究得到11个BKV序列独立的聚为一支,而另外一支由本研究得到的剩余一条VP0序列和GenBank数据库仅有的3条序列组成。另外,这11个本研究得到的BKV VP0序列与另一支中的序列相比均有一个氨基酸插入(S或N)。结果表明,BKV在中国分布较为广泛并且可能与腹泻有关。此外BKV在腹泻阳性本中共感染情况很严重;BKV 3D遗传多样性非常丰富,本研究获得的序列丰富了基因数据库;本研究获得8/15条BKV VP1序列独立分为的3个新的分支可能代表了3个新的谱系;这11/12个VP0序列与GenBank数据库仅有的3条VP0序列和本研究得到1/12个序列相比,表现出独特的氨基酸插入趋势。本研究的结果为进一步研究BKV的感染情况和分子特征提供了参考。2成功获得我国第一条BKV基因组为了进一步研究BKV基因组特征。本研究利用13对引物分段去扩增BKV基因组序列随后序列使用SeqMan软件进行组装。得到了一条包含完整ORF(7395 bp)长为7907 bp的近乎全长的BKV基因组。该基因组从一份来自河南的犊奶牛腹泻阳性样本中得到,命名为CHZ/CHINA(登录号为MK080265)。CHZ/CHINA ORF序列G+C含量占56.14%,编码了一个长度为2465个氨基酸组成的多聚蛋白。

关键词：牛库布病毒基因组奶牛实时荧光定量RT-PCR 牦牛

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