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抗牛呼吸系统疾病主要病原菌的活性成分筛选及作用机理初步研究

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抗牛呼吸系统疾病主要病原菌的活性成分筛选及作用机理初步研究

作者：雷爽吉林农业大学

学位级别：硕士

牛呼吸系统疾病(Bovine respiratory diseases,BRD)给畜牧养殖业造成了严重经济损失,兽医临床主要采用抗菌药物对该病进行防治,但由于抗菌药物的大量不合理使用,导致牛呼吸系统疾病主要病原耐药性愈加严重,针对牛呼吸系统疾病主要病原... 详细信息

牛呼吸系统疾病(Bovine respiratory diseases,BRD)给畜牧养殖业造成了严重经济损失,兽医临床主要采用抗菌药物对该病进行防治,但由于抗菌药物的大量不合理使用,导致牛呼吸系统疾病主要病原耐药性愈加严重,针对牛呼吸系统疾病主要病原开展新型敏感药物的筛选至关重要。为此,本研究基于实验室构建的拮抗菌库,进一步以牛呼吸系统疾病重要病原多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌为指示菌,从中筛选出对指示菌拮抗作用最强的菌株LS8。将LS8次级代谢产物进行分离、纯化后,进行质谱检测,得到分子质量为22.768 k Da的抗菌蛋白PLS8,并对抗菌蛋白PLS8进行生理、生化特性、抗菌谱、安全性以及作用机制的初步测定,主要研究内容如下:(1)通过初筛、复筛,最终从拮抗菌库中筛选出一株对指示菌具有拮抗作用的菌株LS8。通过菌落观察、菌体观察以及分子生物学检测,鉴定该菌株为短小芽孢杆菌。按照最佳发酵条件进行发酵,确定该菌在培养4 h左右开始增长,抗菌物质产生时间在20 h左右,在48 h活性达到最高。确定最佳硫酸铵提取浓度为80%。(2)将菌株LS8发酵浓缩液依次经葡聚糖凝胶层析柱、离子交换柱和高效液相进行分离纯化,采用LC-MS/MS鉴定得到分子量为22.768 k Da的抗菌蛋白。该抗菌蛋白PLS8能够很好的抑制不同动物源且具有不同耐药表型的多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。同时,该抗菌物质具有良好的热稳定性、酸碱稳定性、有机试剂稳定性,且短时间紫外照射不敏感。(3)对抗菌蛋白PLS8进行安全性、有效性评估,结果显示PLS8具有良好的安全性,在256μg/m L时细胞存活率在80%以上,不发生溶血,在160μg/m L时不引起斑马鱼的胚胎毒性;PLS8对感染多杀性巴氏杆菌的大蜡螟及小鼠具有较好治疗作用,20 mg/kg的治疗组,大蜡螟及小鼠的存活率均在85%以上;初步探究了抗菌蛋白PLS8的抗菌作用机制,实验结果表明PLS8可通过破坏细菌外膜,使细胞内的ATP含量降低和ROS增加,进而导致菌体死亡。总之,本研究从拮抗菌库中筛选出一株对牛呼吸系统疾病重要病原多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌具有较好拮抗作用的菌株,对该菌次级代谢产物进行分离纯化,得到抗菌蛋白PLS8,研究结果为抗牛呼吸系统疾病新型抗菌药物的研发奠定了基础。

关键词：牛呼吸系统疾病短小芽孢杆菌细菌素抗菌机制

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牛呼吸系统疾病的防治策略

农家参谋 2021年第19期 135-136页

作者：秦世昌内蒙古赤峰市林西县农牧局动物疫病预防控制中心

牛呼吸系统疾病是由多种病原以及多种致病因素相互作用所引发的一类疾病的总称,该种疾病发生流行具有一定的季节性,往往在每年的冬春季节高发。养殖管理不当,卫生环境较差,有毒有害气体积累,牛群身体瘦弱,极容易受到呼吸道疾病的侵袭,... 详细信息

牛呼吸系统疾病是由多种病原以及多种致病因素相互作用所引发的一类疾病的总称,该种疾病发生流行具有一定的季节性,往往在每年的冬春季节高发。养殖管理不当,卫生环境较差,有毒有害气体积累,牛群身体瘦弱,极容易受到呼吸道疾病的侵袭,影响到牛群的正常生长发育,甚至会造成大量牛死亡。牛呼吸系统疾病可以威胁任何年龄品种的牛,且随着牛年龄的下降,发病率和致死率呈现逐年上升趋势。本文结合实际工作经验,首先探讨了牛呼吸系统疾病的发病原因,后论述了几种呼吸系统疾病的发生与治疗措施,最终提出了综合性的防治方案,希望通过研究对广大同行有所帮助。

关键词：牛呼吸系统疾病发病原因防治策略

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牛呼吸系统疾病研究进展

现代农业科技 2019年第17期 219-220,222页

作者：楚会萌孙阳阳张亮解晓莉任亚初程凯慧杨宏军山东省农业科学院奶牛研究中心

牛呼吸系统疾病是由环境、宿主自身和病原体等诸多因素相互作用引发的呼吸系统综合症,发病率和死亡率均较高,对世界奶牛养殖业造成巨大经济损失。本文综述了国内外对牛呼吸系统疾病诊断、预防和治疗的进展,旨在为其有效防治提供参考。

关键词：牛呼吸系统疾病诊断治疗预防

基于高通量测序分析牛呼吸系统疾病鼻咽微生物多样性和功能预测研究

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畜牧与兽医 2021年第9期53卷 109-118页

作者：张静张涛卢昱希任荣清黄波周思旋王婧赵春萍史开志张雄贵州省农业科学院畜牧兽医研究所/畜禽重大疫病监测防治重点实验室贵州贵阳550002 贵州省农业科学院畜牧兽医研究所/兽用中草药研究室贵州贵阳550002

为研究患呼吸系统疾病(BRD)的牛鼻咽部微生物的多样性及其基因功能,搜集贵州省不同地区3个牛场的患病牛鼻拭子(分别为R1、R2和R3组),利用Illumina高通量测序技术鉴定牛鼻咽部微生物多样性。平均得到细菌类有效序列64 128条,聚类为3 675... 详细信息

为研究患呼吸系统疾病(BRD)的牛鼻咽部微生物的多样性及其基因功能,搜集贵州省不同地区3个牛场的患病牛鼻拭子(分别为R1、R2和R3组),利用Illumina高通量测序技术鉴定牛鼻咽部微生物多样性。平均得到细菌类有效序列64 128条,聚类为3 675个操作分类单元(OTUs);真菌类有效序列65 472条,聚类为2 646个OTUs。经分类学鉴定,细菌类属32个门、52个纲、124个目、233个科和582个属;真菌类属14个门、32个纲、97个目、223个科和407个属。细菌中的优势菌群为拟杆菌门(19.19%-47.15%)和变形杆菌门(16.04%-48.53%);属水平下,致病性细菌有支原体(0.68%-7.82%)、曼氏杆菌(0.19%-3.06%)、不动杆菌(0.74%-10.92%)、巴氏杆菌(0.44%-3.97%)和金黄杆菌(0.25%-2.75%)等。真菌中的优势菌群为子囊菌门(40.73%-61.4%)和担子菌门(6.88%-24.3%);属水平下,致病性真菌有曲霉菌属(1.19%-16.26%)、假丝酵母属(0.19%-7.6%)和克柔氏菌属(2.28%-45.1%)等。细菌类KEGG功能分类注释显示,R1组和R2组代谢类的相关通路丰度增加,R3组疾病感染、信号转导等相关通路丰度增加。真菌功能注释显示3组样品中均存在动物病原菌丰度增加。结果表明,患BRD牛鼻咽部微生物组成相似,但相对丰度存在差异;除常见的菌群外,还存在致病性细菌和真菌。

关键词：牛呼吸系统疾病高通量测序 16S rRNA 鼻咽部微生物微生物多样性功能预测

乳酸菌的分离鉴定及拮抗牛呼吸系统疾病主要病原菌的初步研究

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乳酸菌的分离鉴定及拮抗牛呼吸系统疾病主要病原菌的初步研究

作者：吴信豪吉林农业大学

学位级别：硕士

近年来,牛呼吸系统疾病(bovine respiratory disease,BRD)给我国的肉牛养殖业造成了较严重的经济损失,导致诱发BRD的主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)、牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida,Pm)和牛溶血曼... 详细信息

近年来,牛呼吸系统疾病(bovine respiratory disease,BRD)给我国的肉牛养殖业造成了较严重的经济损失,导致诱发BRD的主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)、牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida,Pm)和牛溶血曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)由于其耐药性不断增强,给该病的预防和控制造成了严重的困扰。因此寻找新型治疗方法,优化治疗策略已迫在眉睫。本研究通过传统分离法对采自延吉、吉林等地的酸奶、泡菜样品中的乳酸菌进行分离鉴定,并以Pm、Mh、M.bovis为指示菌,初步筛选具有拮抗作用的乳酸菌。本实验从样品中共分离得到115株乳酸菌,并以致病菌Pm、Mh、M.bovis为指示菌进行初筛后得到5株具有较好抑菌效果的乳酸菌,分别编号为P5(鼠李糖乳杆菌,Lactobacillus rhamnosus)、P1(植物乳杆菌,Lactobacillus plantarum)、24-1(嗜酸乳杆菌,Lactobacillus acidophilus)、8-1(屎肠球菌,Enterococcus faecium)、Z1(鼠李糖乳杆菌,Lactobacillus rhamnosus)。本研究还对5株乳酸菌的生理特性、溶血活性和耐药性等进行了检测。并对其发酵上清液进行抑菌活性的研究。试验结果表明,复筛出菌株P5抑菌活性最强,生长速度较快,对绝大多数抗生素敏感,无溶血活性,热稳定性好。选取P5株评价其对小鼠BRD肺炎模型的保护作用。结果表明,P5对由Pm和Mh诱发的BRD肺炎小鼠起到明显的预防保护作用。研究结果为BRD新型预防策略的制定提供了理论指导和实验依据。

关键词：牛呼吸系统疾病乳酸菌分离鉴定抗菌保护

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牛呼吸系统疾病的防治策略

畜禽业 2021年第4期32卷 118-118,120页

作者：苟源甘肃省张掖市甘州区长安镇农业农村综合服务中心甘肃张掖734000

就牛呼吸系统疾病发生原因进行了分析,提出了常见呼吸系统疾病临床症状及治疗方法,介绍了其综合预防措施,以期为养牛产业提供参考及借鉴。

关键词：牛呼吸系统疾病临床症状预防治疗措施

中国北方部分地区牛呼吸道综合征主要病原流行病学调查

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中国北方部分地区牛呼吸道综合征主要病原流行病学调查

作者：孙凌炜内蒙古农业大学

学位级别：硕士

在中国,牛呼吸系统疾病是危害养牛业的重要疾病之一,容易导致犊牛的死亡,对成年牛的健康也有较大的危害,牛场的防控难点在于牛呼吸道疾病是由多种病原共同作用而产生的混合感染和继发感染。其发生会使牛群不稳定,还容易导致其他疾病,如... 详细信息

在中国,牛呼吸系统疾病是危害养牛业的重要疾病之一,容易导致犊牛的死亡,对成年牛的健康也有较大的危害,牛场的防控难点在于牛呼吸道疾病是由多种病原共同作用而产生的混合感染和继发感染。其发生会使牛群不稳定,还容易导致其他疾病,如腹泻、繁殖障碍等,造成整个牛场疾病不断,甚至造成疾病的大流行,增加养牛的成本,最终导致巨大的经济损失。但是牛呼吸系统疾病的发生是十分普遍的,并且呈逐年递增趋势,在此背景下,本研究的目的是评估中国北方部分地区的牧场中牛呼吸道综合征的主要病毒性病原和主要细菌性病原的感染情况。以期发现主要的病原,为牛呼吸系统疾病的防控提供理论依据。国内外研究表明牛黏膜病病毒(BVDV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛传染性鼻气管炎(IBRV)和牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)是与牛呼吸道综合征相关的常见病原,并且常常作为牛呼吸道综合征(BRDC)的原发性病原。一般认为这些病毒能够抑制牛免疫系统,并且能破坏呼吸道上皮细胞,使常见的机会性的细菌性次生病原体更容易感染。原发性病原主要是降低牛呼吸系统的抵抗力,继而引起牛感染支原体、溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌等细菌性病原。原发性病原与细菌性病原共同引起呼吸系统疾病的发生。其主要机理是原发性病原通过侵入呼吸道及肺脏和胸膜等部位进,从而破坏呼吸道的防御体系,导致牛的内源性病原体与环境中的外源性病原体共同引起继发性混合感染,从而引起呼吸道综合征。在2020年6月至2021年1月期间,在中国15个牧场收集病料,采取随机采样方式,收集具有呼吸道疾病症状的牛的鼻拭子、血清和因肺炎死亡牛的气管、肺脏组织,并对这些样品进行病原分离鉴定。8个月共收集病料1200份,采用PCR/RT-PCR检测方法和病毒分离培养方法来检测各病原的阳性率。根据检测结果可知BVDV的总阳性率为3.08%(37/1200);BRSV的总阳性率为1.92%(23/1200);IBRV的总阳性率为19%(228/1200);BPIV-3的总阳性率为3.75%(45/1200);多杀性巴氏杆菌的总阳性率为0.17%(2/1200),溶血性曼氏杆菌的总阳性率为0.08%(1/1200),牛支原体的总阳性率为2.17%(26/1200)。其中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单独阳性率为2%(24/1200),牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)单独阳性率为0.75%(9/1200),牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)单独阳性率为18.17%(218/1200),牛副流感三型病毒(BPIV-3)单独阳性率为2.83%(34/1200);多杀性巴氏杆菌单独阳性率为0.08%(1/1200),溶血性曼氏杆菌单独阳性率为0.08%(1/1200),牛支原体单独阳性率为1.75%(21/1200)。BVDV/BRSV混合阳性率为0.33%(4/1200),BVDV/IBRV混合阳性率为0.25%(3/1200),BVDV/BPIV-3混合阳性率为0.42%(5/1200),BVDV/牛支原体混合阳性率为0.08%(1/1200);BRSV/BVDV混合阳性率为0.33%(4/1200),BRSV/IBRV混合阳性率为0.42%(5/1200),BRSV/BPIV-3混合阳性率为0.33%(4/1200),BRSV/牛支原体混合阳性率为0.08%(1/1200);IBRV/BRSV混合阳性率为0.42%(5/1200),IBRV/牛支原体混合阳性率为0.17%(2/1200);BPIV-3/BVDV混合阳性率为0.42%(5/1200),BPIV-3/BRSV混合阳性率为0.33%(4/1200),BPIV-3/多杀性巴氏杆菌混合阳性率为0.08%(1/1200),BPIV-3/牛支原体混合阳性率为0.08%(1/1200)。

关键词：牛呼吸系统疾病流行病学调查预防治疗

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牛鼻咽微生物与呼吸系统疾病发生的辩证关系

山东畜牧兽医 2022年第9期43卷 75-77,81页

作者：刘夕验钱玉玺山东省沂水县动物疫病预防控制中心山东沂水276400

牛鼻咽等上呼吸道黏膜定殖的细菌等微生物群落,在与机体的相互作用中保持动态平衡,与呼吸系统疾病的发生、发展、愈后有密不可分的联系。本文初步分析了牛鼻咽微生物群落(MNG)的组成及作用,辩证阐释了其引发牛呼吸系统疾病(BRD)的潜在机... 详细信息

牛鼻咽等上呼吸道黏膜定殖的细菌等微生物群落,在与机体的相互作用中保持动态平衡,与呼吸系统疾病的发生、发展、愈后有密不可分的联系。本文初步分析了牛鼻咽微生物群落(MNG)的组成及作用,辩证阐释了其引发牛呼吸系统疾病(BRD)的潜在机制,并从牛鼻咽微生物稳态与机体健康的角度入手,提出综合防治举措,旨在帮助养殖从业者增强对牛鼻咽微生物与呼吸系统疾病辩证关系的理解,降低治疗成本、提高防控效率。

关键词：牛呼吸系统疾病牛鼻咽微生物致病性防治

牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌多重PCR-ELISA检测方法的建立及初步应用

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牛支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌多重PCR-ELISA检测方法...

作者：许淑玉吉林农业大学

学位级别：硕士

近年来,牛呼吸系统疾病(bovine respiratory disease,BRD)已成为危害我国肉牛养殖业的主要疾病之一,尤其是在我国“北牛南调,西牛东运”的肉牛育肥模式下,该病的发生和传播更为普遍。据统计,经长途运输的育肥架子牛,有60%左右会发生BRD... 详细信息

近年来,牛呼吸系统疾病(bovine respiratory disease,BRD)已成为危害我国肉牛养殖业的主要疾病之一,尤其是在我国“北牛南调,西牛东运”的肉牛育肥模式下,该病的发生和传播更为普遍。据统计,经长途运输的育肥架子牛,有60%左右会发生BRD。BRD主要由牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)、牛荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida,Pm)和牛溶血曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)引发,部分病例为混合感染。同时,上述病原均为苛养菌,且对常用药物敏感性不同,尤其是牛支原体,不但分离培养周期长,还对兽医临床常用的β-内酰胺类抗生素具有天然抗性,如不能正确做出诊断,就会造成较大经济损失。为此,研发一种可快速、准确鉴定BRD主要病原的方法,已迫在眉睫。其中,PCR-ELISA方法是PCR反应与地高辛检测系统的结合,已普遍用于食品及病原微生物的快速检测,受到了相关学者和基层工作者的青睐。该方法主要是将PCR引物标记地高辛、探针标记生物素并将链霉亲和素结合在ELISA板上,利用生物素与亲和素的高亲和力,将杂交产物固定在ELISA板上,加入酶的相应底物,根据显色反应或酶标仪读取数据判定结果。该方法可实现同时对多种病原体进行定性检测,具有快速、操作简便等特点。为此,本研究利用探针引物双标记法建立了同时检测BRD三种主要病原体的多重PCR-ELISA检测方法。具体实验结果如下:(1)种间特异性基因的筛选将目标菌株的全基因组序列与NCBI的动物nt库以及细菌nt库(去除了目标菌种序列)进行比较,对没有比对到数据库的序列进行筛选,进一步采用orthomcl对目的基因进行聚类分析,最终得到667组牛荚膜A型多杀性巴氏杆菌特异性基因,380组溶血曼氏杆菌特异性基因。(2)多重PCR检测方法的建立根据筛选出的种间特异性基因,建立多重PCR检测方法,对引物条件、退火温度、循环数等进行优化,最终筛选出三对特异性引物,退火温度为54.5℃,最佳循环次数为30。多重PCR的灵敏度Pm为6.8×10CFU/mL、Mh为3.7×10CFU/mL、M.bovis为1.1×10CFU/mL。(3)多重PCR-ELISA检测方法的建立采用化学变性杂交法建立多重PCR-ELISA检测方法,并对条件进行优化,结果显示,包被液(链霉亲和素)浓度为5μg/mL,封闭液(BSA)浓度为0.5%,封闭时间为20min,过氧化物酶标记的抗地高辛抗体稀释1000倍,显色时间为20min,探针浓度为0.5mmol/10mL时,该检测方法灵敏度Pm为6.8×10CFU/mL、Mh为3.7×10CFU/mL、M.bovis为1.1×10CFU/mL。

关键词：牛呼吸系统疾病多重PCR-ELISA 比较基因组学