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牙髓干细胞修复周围神经损伤的研究进展

中华口腔医学杂志 2022年第2期57卷 194-199页

作者：母晓丹刘华蔚李永锋相磊胡敏解放军总医院口腔颌面外科北京100853

周围神经损伤(peripheral nerve injury,PNI)严重影响患者的生命质量及身心健康,并且损伤后的修复在临床上仍面临巨大挑战,PNI与再生修复研究是当今各相关学科研究的热点问题。细胞疗法在组织再生与修复中具有不可替代的作用。施万细胞... 详细信息

周围神经损伤(peripheral nerve injury,PNI)严重影响患者的生命质量及身心健康,并且损伤后的修复在临床上仍面临巨大挑战,PNI与再生修复研究是当今各相关学科研究的热点问题。细胞疗法在组织再生与修复中具有不可替代的作用。施万细胞是周围神经修复的理想细胞,但来源有限等缺点限制了其临床应用。牙髓干细胞来源于神经嵴,为神经再生提供了新的细胞来源。本文就牙髓干细胞修复PNI的研究现状进行综述。

关键词：周围神经神经再生牙髓干细胞

牙髓干细胞通过调控TGF-β1/Smad2/3信号通路抑制肺纤维化的发生

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实用口腔医学杂志 2022年第3期38卷 322-326页

作者：李晓飞刘颖付崇建解放军960医院口腔科济南250031 山东第一医科大学附属省立医院口腔科

目的:探索人牙髓干细胞(hDPSCs)对肺纤维化的抑制作用和分子机制。方法:将64只成年C57BL/6小鼠随机分为4组(n=16),分别给予气管内注射生理盐水2 mg/kg(对照组)、博莱霉素2 mg/kg(BLM组)、BLM+尾静脉注射1×10^(5) hDPSCs(BLM处理后第3天... 详细信息

目的:探索人牙髓干细胞(hDPSCs)对肺纤维化的抑制作用和分子机制。方法:将64只成年C57BL/6小鼠随机分为4组(n=16),分别给予气管内注射生理盐水2 mg/kg(对照组)、博莱霉素2 mg/kg(BLM组)、BLM+尾静脉注射1×10^(5) hDPSCs(BLM处理后第3天)(hDPSCs-1组)、BLM+尾静脉注射1×10^(5) hDPSCs(BLM处理后第7天)(hDPSCs-2组)。BLM处理后28 d处死小鼠,取肺组织,HE和Masson染色。用qRT-PCR检测肺纤维化标志基因的表达。ELISA,qRT-PCR和Western-blot法检测TGF-β1/Smad2/3信号通路相关基因的表达。结果:尾静脉注射hDPSCs显著改善BLM诱导的小鼠肺纤维化和相关基因的表达。hDPSCs通过抑制Smad2/3的磷酸化抑制TGF-β1和Vimentin的表达,促进E-cadherin的表达。结论:hDPSCs能够通过调节TGF-β1/Smad2/3信号通路的激活抑制BLM诱导的小鼠肺纤维化。

关键词：牙髓干细胞肺纤维化 TGF-β Smad2/3

牙髓干细胞来源凋亡小体调节巨噬细胞极化及炎症反应

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口腔疾病防治 2022年第1期30卷 12-19页

作者：宫晟凯杨晓姗窦庚李子涵刘思颖王玮刘世宇第四军医大学基础医学院陕西西安710032 军事口腔医学国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔疾病国际联合研究中心第四军医大学口腔医院组织工程中心陕西西安710032 军事口腔医学国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔医学重点实验室第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科陕西西安710032

目的探讨牙髓干细胞(dental pulpstemcells,DPSCs)释放的凋亡小体(apoptotic bodies,ABs)对巨噬细胞极化及体内炎症反应的调节作用。方法分离培养、鉴定人来源DPSCs并利用星孢菌素诱导其凋亡,对ABs进行表征鉴定。将体外培养的巨噬细胞... 详细信息

目的探讨牙髓干细胞(dental pulpstemcells,DPSCs)释放的凋亡小体(apoptotic bodies,ABs)对巨噬细胞极化及体内炎症反应的调节作用。方法分离培养、鉴定人来源DPSCs并利用星孢菌素诱导其凋亡,对ABs进行表征鉴定。将体外培养的巨噬细胞分为对照组、LPS组以及LPS+ABs组,分别施加溶剂对照处理、LPS处理、LPS和ABs共处理,观察巨噬细胞对ABs的吞噬情况以及各组M型巨噬细胞标志物CD206表达及细胞因子释放水平的差异。构建小鼠皮肤创伤模型及小鼠葡聚糖硫酸钠结肠炎模型,分为PBS组、DPSCs组及ABs组,分别注射PBS对照、DPSCs及DPSCs来源的ABs,观察各组小鼠体重、损伤局部组织形态、CD206表达、组织再生及细胞因子表达等情况的差异。结果分离培养的DPSCs表面标志物及分化潜能符合间充质干细胞特征。DPSCs在凋亡过程中释放的ABs符合典型凋亡小体特征。ABs可被体外培养的巨噬细胞吞噬,并提高LPS处理组巨噬细胞CD206表达、降低其促炎因子肿瘤坏死因子⁃α(tumor necrosisfactor⁃α,TNF⁃α)和白细胞介素⁃6(interleukin⁃6,IL⁃6)的释放,同时增加炎症调节因子转化生长因子⁃β(transforming growthfactor⁃β,TGF⁃β)的释放(P细胞数量(P细胞数量(P细胞极化并调节炎性反应,有望替代活细胞移植应用于炎症调节及组织再生。

关键词：牙髓干细胞巨噬细胞巨噬细胞极化炎症反应凋亡凋亡小体组织再生干细胞移植炎症调节

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牙髓干细胞干性维持的研究进展

国际口腔医学杂志 2023年第4期50卷 463-471页

作者：于乐蓉李祥伟艾虹中山大学附属第五医院口腔科珠海519000 中山大学附属第三医院口腔科广州510000

牙髓干细胞是存在于牙髓组织中的一种牙源性未分化间充质干细胞,具有强大的自我更新能力和多向分化潜能,可在特定刺激条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、成牙本质细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞以及肝细胞等,为其应用于治疗各种组织... 详细信息

牙髓干细胞是存在于牙髓组织中的一种牙源性未分化间充质干细胞,具有强大的自我更新能力和多向分化潜能,可在特定刺激条件下分化为成骨细胞、软骨细胞、成牙本质细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞以及肝细胞等,为其应用于治疗各种组织缺损和修复提供了新的临床思路和方法。牙髓干细胞在体外传代和扩增的过程中不可避免地会出现增殖速度减慢、细胞衰老和多能性减退等干性降低的表现,这严重阻碍牙髓干细胞在组织工程中的应用。如何克服牙髓干细胞干性维持欠佳的不足,以及如何维持牙髓干细胞的干性等问题在组织工程研究中受到广泛关注。本文对牙髓干细胞干性维持的意义,维持方法(包括低温保存、培养维度、低氧环境、应用细胞因子等)及其调控的分子机制等方面的研究进展进行综述。

关键词：牙髓干细胞干性干性维持干性调控机制

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牙髓干细胞多向分化潜能的研究及应用进展

生物医学工程学杂志 2019年第1期36卷 172-176页

作者：葛芳杜立群山东大学齐鲁医院眼科济南250012

牙髓干细胞(DPSCs)是一类成体干细胞,具有较强的增殖能力、自我更新能力、多向分化潜能,且来源丰富、获取方便、不涉及伦理问题,其作为种子细胞已在组织工程和再生医学领域发挥了重要作用,展现了巨大的潜能,有望成为组织修复和器官再生... 详细信息

牙髓干细胞(DPSCs)是一类成体干细胞,具有较强的增殖能力、自我更新能力、多向分化潜能,且来源丰富、获取方便、不涉及伦理问题,其作为种子细胞已在组织工程和再生医学领域发挥了重要作用,展现了巨大的潜能,有望成为组织修复和器官再生的理想种子细胞来源。DPSCs在骨再生领域的研究已应用到临床,而向其他组织的分化研究尚处于不同水平的基础阶段,本文就其在成牙、成骨、成神经等方向分化潜能的相关研究及应用作一综述,为DPSCs在组织工程和再生医学领域的进一步研究提供线索和思路。

关键词：牙髓干细胞分化组织工程

牙髓干细胞诱导来源的腺上皮样细胞超微结构的研究

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牙髓干细胞诱导来源的腺上皮样细胞超微结构的研究

作者：张星魁河北医科大学

学位级别：硕士

目的:唾液腺功能退化严重影响患者的生活质量与水平,从根本上解决唾液腺退化仍是医学上的一大难题。随着再生医学的发展,自体腺上皮样细胞注射为解决唾液腺功能退化提供一种新的治疗方案。本实验旨在研究牙髓干细胞诱导来源腺上皮样细... 详细信息

目的:唾液腺功能退化严重影响患者的生活质量与水平,从根本上解决唾液腺退化仍是医学上的一大难题。随着再生医学的发展,自体腺上皮样细胞注射为解决唾液腺功能退化提供一种新的治疗方案。本实验旨在研究牙髓干细胞诱导来源腺上皮样细胞与腺上皮细胞及牙髓干细胞之间在超微结构上的异同之处及其功能变化,为再生医学治疗唾液腺功能退化提供新的治疗思路。方法:1.原代细胞的培养与鉴定1.1牙髓干细胞培养与鉴定:收集人牙髓组织取自于本院正畸减数拔除的前磨牙。取出牙髓组织后,采用组织块酶消化法培养原代牙髓细胞,采用流式细胞术对细胞进行鉴定。1.2腺上皮细胞培养与鉴定:收集人体本院因颈部淋巴结清扫术后下颌下腺标本,采用组织块酶消化法培养原代腺上皮细胞,通过免疫细胞化学染色法对细胞进行鉴定。2.建立人牙髓干细胞与腺上皮细胞共培养体系:本实验采用transwell小室完成共培养体系的建立。牙髓干细胞第3代,以1×10个/ml密度接种于transwell下层培养室内进行培养(以下简称共培养细胞),待细胞贴壁后,将人腺上皮细胞第三代,以4×10个/ml密度接种transwell上层培养室。单独培养的牙髓干细胞与腺上皮细胞作为对照,培养基每两天更换一次。共培养12天,每天观察细胞形态。3.透射电镜观察:选取第2、4、6、8、10和12天的共培养细胞,牙髓干细胞第3代与腺上皮细胞第3代,透射电镜观察和拍照。4.免疫细胞化学染色:选取第4、8、12天的共培养细胞,爬片成功后免疫细胞化学染色法鉴定CK-8和vimentin表达情况。5.唾液淀粉酶的测定:在共培养第2、4、6、8、10和12天去除上层腺上皮细胞,加入含有10%胎牛血清的培养液3ml,置于37℃恒温箱培养3天后,使用α-淀粉酶(AMS)测试盒测定其上清液中淀粉酶活性。6.CCK-8法测定增殖曲线:选取第2、4、6、8、10、12天共培养细胞,采用CCK-8法测定在其在450 nm处吸光度值。结果:1.在共培养过程中,共培养细胞出现了腺上皮样的多边形细胞,这些细胞紧密聚集,形成岛状结构,并在部分细胞岛的顶端可见串珠样气泡。这些细胞岛的数量在第8天达到顶峰后开始逐渐减少。在第10-12天共培养细胞逐渐转变为扁平状,紧密排列,细胞岛数量减少,串珠样分泌气泡减少甚至消失。2.在透射电镜下共培养细胞在第2天和第4天细胞内可见大量的线粒体,并可见许多核糖体及发达的粗面内质网;在共培养第6天可见细胞内可见少量的分泌颗粒样结构,并可见发达的粗面内质网,核糖体和线粒体的数量增多;在第8天分泌颗粒样结构数量进一步增多,并出现较多的空泡样结构;在第10和12天细胞内可见分泌颗粒样结构与空泡样结构数量减少,线粒体与粗面内质网未见明显减少。这些超微结构的改变明显区别于牙髓干细胞,与腺上皮细胞有着相似之处。3.免疫细胞化学染色显示:在共培养过程中,共培养细胞中vimentin表达逐渐降低,CK-8表达逐渐升高,在单独培养的牙髓干细胞中未发现此种改变,表明牙髓干细胞逐渐丧失间充质干细胞的特征,开始向上皮细胞转化。4.通过α-淀粉酶(AMS)测试法发现共培养细胞具有分泌唾液淀粉酶的能力,唾液淀粉酶活性随着共培养时间逐渐上升,在第8天达到顶峰后开始逐渐下降。共培养细胞上清中唾液淀粉酶活性与腺上皮细胞在第8至12天未见无明显统计学差异(P>0.05),两者均明显高于单独培养的牙髓干细胞(P细胞的平均吸光度值逐渐增高,在第4天开始进入对数期,在第8天达到顶峰。共培养细胞与牙髓干细胞平均吸光度值之间无明显的统计学差异(P>0.05),两者均明显高于腺上皮细胞(P牙髓干细胞在与腺上皮细胞共培养过程中可以转化为腺上皮样细胞,且增殖能力与牙髓干细胞无明显差异,明显优于下颌下腺来源的腺上皮细胞。2.牙髓干细胞在腺上皮细胞共培养诱导过程中自诱导第6天开始具备与腺上皮细胞相似的超微结构,超微结构变化与细胞光镜下形态、CK-8及vimentin表达变化及分泌功能变化基本一致,其中线粒体与粗面内质网可能在诱导过程中对细胞结构和功能转化起着重要作用。3.牙髓干细胞诱导来源腺上皮样细胞具有与腺上皮细胞同样的良好分泌功能,为解决腺体功能减退提供可靠的组织工程细胞来源。

关键词：腺上皮细胞牙髓干细胞透射电镜诱导分化间充质-上皮转化

牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响

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上海口腔医学 2020年第5期29卷 466-470页

作者：李月玲杨佳音徐睿上海市嘉定区牙病防治所上海201899

目的:研究牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响,并初步探讨其机制。方法:从人牙髓中提取,培养牙髓干细胞,与皮肤成纤维细胞分组共培养,分为3组:对照组(单纯皮肤成纤维细胞培养)、条件培养基组(利用牙髓干细胞条件培养基培... 详细信息

目的:研究牙髓干细胞对皮肤成纤维细胞衰老及增殖能力的影响,并初步探讨其机制。方法:从人牙髓中提取,培养牙髓干细胞,与皮肤成纤维细胞分组共培养,分为3组:对照组(单纯皮肤成纤维细胞培养)、条件培养基组(利用牙髓干细胞条件培养基培养成纤维细胞)、直接共培养组(采用Transwell共培养小室)。共培养后,进行β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色,检测成纤维细胞的衰老情况;利用CCK-8法检测各组成纤维细胞的活性;流式细胞仪分析成纤维细胞的细胞周期变化;采用RT-PCR和Western免疫印迹检测各组成纤维细胞衰老相关蛋白p21、p53以及pRb的mRNA和蛋白表达水平。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与空白组相比,后2组的皮肤成纤维细胞表达β半乳糖苷酶降低、增殖能力增强、G1期细胞减少而S期和G2期增多,p53、p21 mRNA和蛋白表达水平降低而PRb表达升高。结论:牙髓干细胞及其条件培养基具有抗皮肤成纤维细胞衰老的作用,为牙髓干细胞在抗皮肤衰老方面的临床应用提供了依据。

关键词：牙髓干细胞皮肤成纤维细胞共培养条件培养基抗衰老

脂多糖刺激人牙髓干细胞分泌的外泌体联合基质细胞衍生因子-1对牙髓再生的影响

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中华口腔医学杂志 2022年第1期57卷 60-67页

作者：蓝彬园林熹陈文瑨谢婧陈文霞广西医科大学口腔医学院·附属口腔医院牙体牙髓科广西壮族自治区卫生健康委员会口腔感染性疾病防治重点实验室广西口腔颌面修复与重建研究重点实验室南宁530021

目的探讨轻度炎症状态下人牙髓干细胞(human dental pulp stem cell,hDPSC)产生的外泌体与基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)联合应用对牙髓组织再生的影响。方法分离培养hDPSC,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激hDPSC,超速离心法提取hDPSC经LPS刺激后产生的外泌体(exosomes from lipopolysaccharide-stimulated hDPSC,L-EXO)和正常状态下分泌的外泌体(exosome from normal hDPSC,N-EXO),通过透射电镜和蛋白质印迹法鉴定提取物。将40只6~8周龄的SD大鼠通过随机数字表法分为S组(单独应用SDF-1)、L+S组(SDF-1与L-EXO联合应用)、N+S组(SDF-1与N-EXO联合应用)和空白对照组(根管内不植入任何物质),每组10只。以双侧下颌第一磨牙为实验牙,建立大鼠无髓根管模型,根据分组分别在根管内植入不同的内容物。植入后30 d过量麻醉处死所有大鼠,取大鼠双侧下颌骨组织,应用HE、Masson及免疫组织化学染色法进行组织学评价。结果HE染色结果显示,除空白对照组外,其他3组根管内均可见新生牙髓样组织,其中L+S组根管内新生组织的量及组织中的细胞数量最多,S组最少。Masson染色结果显示,L+S组矿化组织沿根管壁纵向排列,胶原纤维有序排列,N+S组呈无规律紊乱分布。定量分析各组新生血管面积,结果显示L+S组血管密度[(2.03±0.65)%]显著高于S组[(0.65±0.05)%]及N+S组[(1.06±0.38)%](F=5.879,P<0.05)。免疫组织化学结果显示,S组及L+S组的趋化因子受体4表达量显著低于N+S组(F=8.633,P<0.01)。结论hDPSC分泌的外泌体联合SDF-1可提高根管内新生组织的量和组织中的血管密度,L-EXO的作用较N-EXO强,并且新生组织中胶原纤维及矿化组织的排列更规律有序。

关键词：干细胞外泌体牙髓干细胞脂多糖基质细胞衍生因子-1 牙髓再生

成牙本质方向分化牙髓干细胞外泌体形态及微小RNA表达谱特征

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北京大学学报（医学版） 2023年第4期55卷 689-696页

作者：叶雨阳岳林邹晓英王晓燕北京大学口腔医学院·口腔医院牙体牙髓科国家口腔医学中心国家口腔疾病临床医学研究中心口腔生物材料和数字诊疗装备国家工程研究中心口腔数字医学北京市重点实验室国家卫生健康委员会口腔医学计算机应用工程技术研究中心国家药品监督管理局口腔材料重点实验室北京100081

目的:研究成牙本质方向分化下牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)来源外泌体的特征,比较其与普通培养下DPSCs来源外泌体的微小RNA(microRNA)表达差异,并分析其相关信号传导通路。方法:(1)分别采用α-基础伊格尔(氏)培养基(αmini... 详细信息

目的:研究成牙本质方向分化下牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)来源外泌体的特征,比较其与普通培养下DPSCs来源外泌体的微小RNA(microRNA)表达差异,并分析其相关信号传导通路。方法:(1)分别采用α-基础伊格尔(氏)培养基(αminimum Eagle’s medium,α-MEM,Hyclone公司,美国)和成牙本质方向分化培养基培养DPSCs 21 d,使用茜素红矿化结节染色和碱性磷酸酶染色对两种细胞进行鉴定。分别在两种细胞上清液中提取外泌体,命名为普通培养条件下DPSCs外泌体(dental pulp stem cells-exosomes,DPSCs-Exo)和成牙本质方向分化培养条件下DPSCs外泌体(dental pulp stem cells-odontogenic-exosomes,DPSCs-OD-Exo)。采用透射电镜观察法、纳米粒子示踪分析法和蛋白印迹法观察比较两种外泌体的形态、粒径分布和外泌体标记蛋白表达情况。(2)采用microRNA芯片法分析DPSCs-Exo和DPSCs-OD-Exo的microRNA表达谱差异,选择差异表达最显著的3种micro-RNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR)验证。对差异表达的microRNA采用microRNA目标预测数据库及基因信号通路数据库进行分析,预测microRNA在DPSCs成牙本质方向分化中的信号传导途径。结果:(1)普通培养条件下的DPSCs呈梭形、多角形等典型的成纤维细胞样形态,成牙本质方向诱导分化21 d后的DPSCs也基本呈梭形、多角形。成牙本质方向诱导分化条件下的细胞茜素红矿化结节染色结果镜下可见大量色暗沉积物形成,碱性磷酸酶染色结果显示细胞颜色深染呈深蓝色,而普通培养条件下的细胞则未见明显染色。两种培养条件下的DPSCs-Exo和DPSCs-OD-Exo形态一致,均呈茶托样,具有双层膜结构。DPSCs-Exo粒径峰值为(114.67±9.07)nm,DPSCs-OD-Exo粒径峰值为(134.00±8.54)nm。DPSCs-OD-Exo的粒径峰值稍大于DPSCs-Exo,差异有统计学意义(t=58.00,P<0.05)。DPSCs-Exo和DPSCs-OD-Exo均表达外泌体标志蛋白肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene,TSG)101蛋白、CD63,符合外泌体特征。(2)microRNA芯片结果显示DPSCs-Exo与DPSCs-OD-Exo的microRNA表达谱存在差异,其中19个增加2倍以上,1个减少64%。real-time PCR验证结果显示,microRNA表达谱中差异表达的microRNA-1246、microRNA-100-5p和microRNA-494-3p在DPSCs-Exo与DPSCs-OD-Exo中存在差异,且差异有统计学意义(P<0.05)。通过microRNA目标预测数据库及基因信号通路数据库对差异表达的microRNA进行分析,预测差异表达的microRNA可靶向轴抑制蛋白2(axis inhibition protein 2,AXIN2)基因及Wnt/β-catenin信号传导通路。结论:DPSCs-OD-Exo与DPSCs-Exo均符合外泌体特征,两者的microRNA表达谱存在差异,差异表达的microRNA可能参与调控DPSCs成牙本质方向分化。

关键词：牙髓干细胞外泌体微小RNA