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促进小鼠牙胚间充质细胞牙源性潜能维持的培养体系优化研究

促进小鼠牙胚间充质细胞牙源性潜能维持的培养体系优化研究

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作者：吴迪吉林大学

学位级别：硕士

牙齿是人类生长发育过程中重要的器官,牙齿损伤和牙齿脱落已成为最常见的口腔疾病,牙齿缺失会导致咀嚼、语言和美观等方面出现问题,会不同程度地影响人类的生活质量。现有传统的牙齿修复方法,存在使用寿命短、使用感受差、生物相容性差... 详细信息

牙齿是人类生长发育过程中重要的器官,牙齿损伤和牙齿脱落已成为最常见的口腔疾病,牙齿缺失会导致咀嚼、语言和美观等方面出现问题,会不同程度地影响人类的生活质量。现有传统的牙齿修复方法,存在使用寿命短、使用感受差、生物相容性差等问题。因此,如何获得在功能和形态上类似天然牙齿的再生牙齿成为目前口腔医学领域研究的热点。牙齿的发育依赖于来自口腔上皮和周围的间充质之间的相互作用,同时受到各种信号通路的调控。在牙齿形成过程中,组织之间的相互作用表现为,其中一种组织产生诱导信号,另一种组织接收并响应信号,前一种组织具有的诱导能力称为牙源性潜能(odontogenic potential)。上世纪的经典重组实验证实了牙源性潜能首先出现在牙胚上皮中,继而在蕾状期(embryo day 12-13,E12-13)转移到间充质中。可见,早期的牙胚上皮可以诱导牙源性或非牙源性的间充质形成牙齿;而蕾状期之后的牙胚间充质可以诱导牙源性上皮或非牙源性上皮形成牙齿。由此,帽状期E14.5的小鼠牙胚间充质细胞常常作为构建再生牙齿的诱导信号细胞来源。然而,新鲜分离的牙胚间充质细胞数量十分有限,大大制约了再生牙齿相关的体外构建研究。本课题组此前已发现E14.5的小鼠牙胚间充质细胞在体外培养过程中易丧失牙源性潜能(MEF培养基),通过初步优化也仅可以在体外持续维持其牙源性潜能48小时(无血清KSR培养基,knockot serum replacement,KSR)。为进一步延长体外培养的牙胚间充质细胞牙源性潜能的维持时间,明确体外培养过程中牙源性潜能变化的机制,本课题中我们在无血清的培养条件基础上进一步优化了牙胚间充质细胞的体外培养体系,并通过对优化前后的体外细胞样品进行转录组测序,从而解析体外维持牙源性潜能的关键因子,为全牙再生中启动诱导成牙信号的研究提供相关的科学依据。在本研究中,我们建立了一种新型的培养体系,即无血清新型培养基(简称NM)。通过与MEF(DMEM+10%FBS)、KSR(DMEM+20%KSR)两种培养体系的对比,我们对分离的E14.5牙胚间充质细胞在三种培养体系中的生长状态进行观察,通过实时定量PCR鉴定细胞中成牙相关基因的表达,并收集不同培养条件下不同时间点的体外培养细胞,与E14.5无诱导能力的牙源性小鼠牙胚上皮重组获得重组牙胚样品,继而移植到小鼠肾包膜中进行重组样品的成牙能力鉴定。重组样品移植3周后被取出,并进行相关的成牙情况检测及组织学鉴定。此外,我们通过转录组测序分析不同培养条件下的间充质细胞样品转录组之间的差异,从而尝试解析牙源性潜能维持的机制。实验结果显示,牙胚间充质细胞在MEF和KSR培养基中贴壁生长,形态呈长梭形;在NM培养基中细胞成簇,培养4天后部分细胞悬浮成球,这说明NM促进细胞悬浮培养,可以模拟立体培养环境。我们进一步发现,牙齿发育相关基因Dlx2、Lhx6、Lhx8、Msx2、Msx1在NM组中的表达水平高于MEF和KSR组。随着传代次数的增加,NM中间充质细胞在成牙基因的表达水平呈梯度下降,特别是Msx1的表达量下调了40%,这些数据说明了NM中体外培养的间充质细胞的牙向发育的相关能力在传代过程中逐渐丧失。重组实验移植物的组织学检测结果显示,在MEF和KSR培养基中体外培养24小时的牙胚间充质细胞,分别与E14.5牙胚上皮重组后均可以形成牙齿,且成牙率为100%,但体外培养时间超过24小时的间充质细胞与E14.5天的牙胚上皮重组后无法形成牙齿。在NM中培养1、4、7天的细胞与E14.5天的牙胚上皮重组后均获得了牙齿样结构,且呈现了较高的成牙率,分别为83.3%、58.3%和66.7%,但是NM组中传代后的细胞参与构建的重组样品无法形成牙齿。转录组测序数据显示,体外培养牙胚间充质细胞在不同培养条件下及培养时间点呈现明显的基因表达差异。其中,NM条件下培养4天的细胞组(NM成牙组)和MEF条件下培养4天的细胞组(MEF不成牙组)中Bmp4的表达呈现显著差异,即Bmp4在成牙组中呈现表达水平较低,而在不成牙组中呈现表达水平较高。为了明确Bmp4在成牙能力中的作用,我们分别对NM成牙组和MEF不成牙组的培养体系里添加了BMP4蛋白和BMP通路的小分子抑制剂DM(dorsomorphin),体外培养4天后收取细胞与E14.5牙胚上皮重组并移植到肾包膜中。3周后,我们发现NM成牙组在添加了BMP4后,成牙率由原来的90%左右降为0,而MEF不成牙组在添加了DM后,成牙率由0升高为50%。这一结果说明,BMP4蛋白的添加会抑制体外牙胚间充质细胞牙源性潜能的维持,而抑制BMP通路可在一定程度上促进体外牙胚间充质细胞牙源性潜能的维持。由此可见,Bmp4在调控牙胚间充质细胞体外培养过程中成牙能力的维持上起到了重要作用。综上所述,我们优化的

关键词：牙胚间充质细胞体外培养牙源性潜能牙齿再生转录组测序

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以CD24为标志的牙胚发育晚期间充质细胞群的功能研究

以CD24为标志的牙胚发育晚期间充质细胞群的功能研究

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作者：张嘉书吉林大学

学位级别：硕士

牙齿再生是目前口腔研究领域的热点之一。如何获得具有诱导成牙能力的种子细胞,是成功构建再生牙齿的核心环节。既往研究以牙齿再生为目标,报道了多种可参与再生牙齿构建的种子细胞。但是,若非借助牙胚来源的部分细胞或组织,研究人员尚... 详细信息

牙齿再生是目前口腔研究领域的热点之一。如何获得具有诱导成牙能力的种子细胞,是成功构建再生牙齿的核心环节。既往研究以牙齿再生为目标,报道了多种可参与再生牙齿构建的种子细胞。但是,若非借助牙胚来源的部分细胞或组织,研究人员尚无法实现仅基于成体获得的种子细胞的再生牙构建。因此,进一步地通过剖析发育过程中能发出成牙指令、或者具有诱导成牙潜能的牙胚细胞更全面的特征,将为明确再生牙构建所需的种子细胞的特征,提供最可靠的理论依据和实践基础。小鼠牙胚的发生发育主要历经牙板期、蕾状期、帽状期和钟状期等,是在BMPs、FGF、Wnts及SHH等信号家族调控下,一系列时空事件中上皮和间充质两层组织间相互作用的结果。本课题组前期通过单细胞转录组数据,对小鼠磨牙牙胚发育过程中,具有诱导成牙潜能的间充质细胞(蕾状期和钟状期的间充质细胞)进行了解析,发现分别受转录因子Barx1和Foxf1调控的两个高度活跃的基因调控网络(Gene regulatory networks,GRNs),确定了与成牙相关的Barx1和与成骨相关的Foxf1在牙胚发育的各重要时期中的表达情况。此外,课题组发现细胞表面标记分子CD24a与Barx1存在共同表达区域,且在发育晚期(钟状期)存在着一群主要分布于牙乳头上半部分的强表达CD24a的间充质细胞。这群细胞是否是发育晚期具有诱导成牙潜能的牙胚间充质中最核心,最有效的发出指令的细胞群,尚待展开系统性研究。本研究首先通过免疫组化法,明确了CD24a对应的蛋白形式CD24在钟状期磨牙胚(Embryonic day 16.5,E16.5)的分布情况类似于CD24a的表达位置,进而通过流式细胞术检测了CD24在E16.5磨牙牙胚间充质细胞中的阳性率情况,发现存在CD24强阳(CD24)、CD24弱阳(CD24)以及CD24阴性(CD24)等三个细胞群,所占比例分别是40%、36%、3.1%。我们在小鼠新生1天(Postnatal1,PN1)的磨牙牙胚间充质细胞中同样观察到了这三个细胞群,所占比例分别是7.4%、20%、17.8%。为了进一步明确以CD24为分选标志的这三个细胞亚群在牙齿发育过程的功能,我们一方面对比了CD24细胞组和CD24细胞组的牙源性基因表达水平,q PCR检测结果显示,Barx1、Bmp4、Lef1、Pax9和Wif1等牙源基因在CD24细胞组中呈现较高的表达水平。另一方面,我们根据CD24的表达分布,针对E16.5的磨牙牙胚间充质,采用流式分选法获得CD24和CD24细胞群,并通过经验切割法获得相应分布位置的牙乳头上半部分(Dental papilla,DP1)和下半部分DP2,进而分别通过与牙源或非牙源上皮的重组实验验证细胞亚群的诱导成牙潜能。结果显示,CD24和CD24两组细胞在与E16.5牙源上皮重组后的成牙率分别是79.41%(n=27/34)和23.08%(n=6/26);在与非牙源的E10.5第二鳃弓上皮重组后的成牙率,则分别是16.7%(n=1/6)和0%(n=0/5)。这说明CD24细胞组相对于CD24细胞组,呈现了显著的诱导成牙能力的优势。对应CD24强阳细胞分布的DP1组(64.52%,n=20/31),在重组实验中相对于对应CD24弱阳细胞分布的DP2组(23.81%,n=5/21),同样表现出较高的成牙率,以及较高的诱导成牙潜能。我们进一步通过将PN1时期分选获得CD24和CD24细胞直接移植到特定脱细胞基质的猪牙本质(Tooth dentin matrix,TDM)的中空腔内培育,发现前者形成功能组织模块(牙髓牙本质复合体)的牙向分化潜能呈现显著优势。此外,我们还利用了micro-CT和免疫组化方法,明确了CD24组能够形成形态相对较好、牙齿体型较大的牙齿。综上所述,在牙胚发育晚E16.5的牙源间充质细胞存在以CD24为标志的细胞群,不仅具有显著的诱导上皮组织共同成牙的潜能,还具有向牙本质牙髓复合体分化的潜能。本研究的结果明确了以CD24为标志的牙胚间充质细胞亚群,是牙胚晚期间充质中发出成牙指令的核心细胞群,具有决定牙向分化命运的潜能。这是首次对磨牙胚发育过程中的细胞亚群的高分辨率图谱描绘和功能解读,为牙齿再生的间充质种子细胞的明确特征,提供了科学依据。

关键词： CD24 牙胚间充质细胞牙源性潜能关键细胞群

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