检索结果-南通市图书馆

作者：王竞儒天津农学院

学位级别：硕士

细菌素与乳酸作为乳酸菌的抑菌代谢产物,具有协同抑制革兰氏阴性菌的潜力。本研究以IIa类细菌素的典型代表片球菌素pa-1,结合亚抑制浓度L-乳酸,探讨二者对水产革兰氏阴性病原菌-嗜水气单胞菌的协同抑制作用,并从细胞和分子水平,初步揭... 详细信息

细菌素与乳酸作为乳酸菌的抑菌代谢产物,具有协同抑制革兰氏阴性菌的潜力。本研究以IIa类细菌素的典型代表片球菌素pa-1,结合亚抑制浓度L-乳酸,探讨二者对水产革兰氏阴性病原菌-嗜水气单胞菌的协同抑制作用,并从细胞和分子水平,初步揭示了协同抑菌机理。研究结果如下:(1)pa-1与L-乳酸协同处理对嗜水气单胞菌有生长抑制和致死作用。pa-1与L-乳酸对嗜水气单胞菌ATCC 35654和CICC 10500菌株的最小抑菌浓度分别为3.5mmol/L L-乳酸+50μmol/L pa-1和3.5 mmol/L L-乳酸+30μmol/L pa-1。二者协同处理可显著延长两株菌的生长延滞期,降低平台期OD值和最大比生长速率。在最小抑菌浓度下处理嗜水气单胞菌8 h,两株菌的死亡率均大于60%。(2)pa-1与L-乳酸协同处理可损伤嗜水气单胞菌内外膜。低浓度L-乳酸处理使菌体外膜脂多糖释放,且释放量随L-乳酸浓度的升高而增多;激光共聚焦成像显示,pa-1可接触乳酸处理后的菌体。pa-1与L-乳酸协同处理可导致细胞膜通透性增强,胞内核酸、蛋白和ATP泄露,造成跨膜电动势和质子动势消散;SEM和TEM图像证明,pa-1与L-乳酸协同处理造成菌体细胞内膜和外膜损伤,胞内物质泄漏,DNA结构异常以及细胞形变。(3)pa-1与L-乳酸协同处理影响嗜水气单胞菌基因转录水平。pa-1与L-乳酸协同处理对数生长期嗜水气单胞菌ATCC 35654菌体20 min,引起菌体细胞:甘氨酸甜菜碱转运系统和多个药物外排泵基因转录水平下调,提示内稳态失衡和耐药性下降;能量代谢,细胞壁合成,鞭毛合成,Ton B系统基因转录水平上调,是菌体对抗胁迫的积极响应。研究结果完善了细菌素与乳酸协同抑杀G菌的理论基础,为细菌素与乳酸及其产生菌作为抗生素替代品对抗嗜水气单胞菌提供了依据。

关键词：片球菌素pa-1 L-乳酸嗜水气单胞菌生长抑制膜损伤转录组

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片球菌素pediocin pa-1基因在大肠埃希菌中的融合表达

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中国微生态学杂志 2009年第11期21卷 961-964,969页

作者：马淑霞吴庆田孙红娇李春江李丽秋王春敏任继秋杨景云佳木斯大学基础医学院微生物教研室黑龙江佳木斯154007 佳木斯大学儿童神经康复实验室黑龙江佳木斯154007

目的构建编码细菌素pediocin pa-1基因片段的原核表达载体,诱导表达,鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pET32-papa,IPTG诱导表达,用金属亲和层析纯化,并通过SDS-paGE与Westernblot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果双酶切和... 详细信息

目的构建编码细菌素pediocin pa-1基因片段的原核表达载体,诱导表达,鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pET32-papa,IPTG诱导表达,用金属亲和层析纯化,并通过SDS-paGE与Westernblot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果双酶切和测序鉴定显示papa片段插入正确,诱导表达后获得分子量为19 kD的融合蛋白,表达量为25%,用金属亲和层析的方法获得纯化的片球菌素pediocin pa-1。结论papa基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,为下一步研究该功能域的生物活性奠定了基础。

关键词：乳酸片球菌片球菌素pa-1 融合蛋白原核表达

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戊糖片球菌C-2-1的生物信息学分析及产pa-1片球菌素的研究

戊糖片球菌C-2-1的生物信息学分析及产PA-1片球菌素的研究

引用

作者：黄宇良上海海洋大学

学位级别：硕士

近年来食品安全事件频发,其中由微生物引起的食品腐败和食源性疾病占很大一部分比例。化学防腐剂的添加可有效抑制食品中的腐败微生物,但人工防腐剂易在人体内蓄积,长期摄入对人体具有潜在危害性,急需发现新的天然食品防腐剂来作为替代... 详细信息

近年来食品安全事件频发,其中由微生物引起的食品腐败和食源性疾病占很大一部分比例。化学防腐剂的添加可有效抑制食品中的腐败微生物,但人工防腐剂易在人体内蓄积,长期摄入对人体具有潜在危害性,急需发现新的天然食品防腐剂来作为替代品。而由乳酸菌产生的细菌素对人体无危害作用,可被人体胃肠道内蛋白酶降解消化,具有作为食品生物防腐剂的潜在应用价值。片球菌素pa-1即是由戊糖片球菌产生的一种细菌素,相比于Nisin在pH6.0时就有90%以上的活性丧失的特点,其性质更稳定,抑菌谱较广,对单增李斯特菌的抑制作用尤为明显,在食品防腐保鲜领域中具有更广泛的应用前景。本研究以实验室前期从内蒙古干酪中筛选出的能产生片球菌素pa-1的戊糖片球菌C-2-1菌株为基础,对该菌株进行了全基因组测序研究,并对菌株进行安全性评价。对戊糖片球菌C-2-1产片球菌素pa-1进行了固定化细胞发酵条件优化,以及片球菌素pedA基因的原核表达与蛋白纯化,并进一步研究了信号肽在片球菌素pa-1可溶性表达中的作用机制。具体研究方法如下:(1)戊糖片球菌C-2-1全基因组测序及分析。利用全基因组测序技术对戊糖片球菌C-2-1基因组进行研究,预测了其基因组的组分并注释相应的功能基因,并进一步探究了戊糖片球菌C-2-1的代谢途径。戊糖片球菌C-2-1基因组总长度为1643106bp,共含有1946个基因。GC含量为37.87%,共84个Scaffolds,93个Contigs;COG蛋白功能注释后发现共有1371个基因成功获得COG功能注释。最多的功能归类为碳水化合物转运和新陈代谢,共有144个基因,占10.5%。参与翻译,核糖体结构和生物合成的基因有140个,占10.07%;1007个基因在GO数据库中成功得到了注释,包含了生物学过程(20个分支)、细胞组分(12个分支)和分子功能(11个分支)三大亚类。生物学过程类中细胞过程和代谢过程最为活跃,细胞组分类别中涉及基因最多的为细胞和细胞部位,分子功能类别中结合和催化活性起着重要作用。KEGG富集分析显示戊糖片球菌C-2-1的基因中能对应到KEGG pathway的有1102个基因,共存在于126条代谢通路中,其中参与次级代谢产物的生物合成的基因有113个。antiSMASH软件预测戊糖片球菌C-2-1基因组得到13个基因簇,预测到了单一的细菌素合成基因簇,位于Cluster 4基因簇,在戊糖片球菌C-2-1基因组上的位置信息为scaffold1,起始基因位点为405542-411580。还预测到5个糖类合成基因簇,2个脂肪酸合成基因簇,5个未知基因簇。最后运用ARDB和VFDB数据库对菌株的安全性进行了初步评价,ARDB抗生素抗性基因数据库和VFDB致病菌毒力因子数据库对比后发现,戊糖片球菌C-2-1不含有抗生素抗性基因,且不含有侵袭性毒力因子,可基本断定戊糖片球菌C-2-1的菌株安全性良好。戊糖片球菌C-2-1基因组信息的获得,为以后的戊糖片球菌C-2-1产细菌素的相关研究提供了丰富的理论基础。(2)片球菌素pa-1的固定化细胞发酵生产条件优化。以海藻酸钙为原材料,采用包埋法对戊糖片球菌C-2-1细胞进行固定化发酵培养,首先利用单因素实验确定了固定化细胞发酵时间和温度分别为42h和30℃,在此培养条件下,利用响应面分析法确定了固定化细胞发酵生产片球菌素的各因素的最佳值为:氯化钙浓度2.41%,海藻酸钠浓度1.68%,固定化颗粒接种量11.68%,菌体包埋量0.066。在此预测条件下经实际测定后的抑菌活性与预测值接近,表明本实验获得的模型可用于戊糖片球菌C-2-1固定化细胞产片球菌素能力的预测。经固定化细胞制备和发酵过程中各因素优化后,戊糖片球菌C-2-1固定化细胞片球菌素的抑菌活性提高了36.9%。(3)片球菌素pedA基因的原核表达与蛋白纯化。以戊糖片球菌C-2-1菌株的总DNA为模板,设计引物扩增片球菌素pa-1成熟肽的结构基因pedA,构建了pET28a-pedA重组质粒,转入大肠杆菌后经诱导表达、Ni-NTA柱纯化、Tricine-SDS-paGE电泳分析后,获得了分子量在7.8kD左右的可溶性重组蛋白,与Protparam蛋白分析工具的分子量预测值相符。经单核细胞增生李斯特菌抑菌检测显示,重组片球菌素具有明显的抑菌活性。本实验成功表达的可溶性重组片球菌素pa-1未加入分子伴侣及融合蛋白,使得重组pa-1的提取、纯化更简单,为以后片球菌素pa-1在食品防腐保鲜领域的应用奠定了很好的基础。运用生物信息学手段,进一步分析了重组片球菌素pa-1的结构信息,其结构中含有的α-螺旋结构可能与本实验重组蛋白在大肠杆菌体内可溶性表达相关。(4)信号肽在片球菌素pa-1可溶性表达中的作用机制研究。实验首先运用生物信息学方法进行比较分析两种P

关键词：戊糖片球菌片球菌素pa-1 全基因组测序细胞固定化 pedA基因可溶性表达信号肽

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片球菌素Pediocinpa-1抑菌活性检测

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中国微生态学杂志 2011年第9期23卷 800-801页

作者：马淑霞李丽秋丁思任继秋吴庆田张昆杨春佳崔刚胡新俊代月王春敏佳木斯大学基础医学院微生物教研室黑龙江佳木斯154007 大庆油田总医院集团黑龙江大庆163319

目的检测通过基因工程获得的片球菌素Pediocin pa-1抑菌活性。方法采用琼脂扩散法检测片球菌素Pediocin pa-1对单核细胞增生李斯特杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和大肠埃希菌O157的抑菌活性。结果片球菌素Pediocin pa-1... 详细信息

目的检测通过基因工程获得的片球菌素Pediocin pa-1抑菌活性。方法采用琼脂扩散法检测片球菌素Pediocin pa-1对单核细胞增生李斯特杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和大肠埃希菌O157的抑菌活性。结果片球菌素Pediocin pa-1对单核细胞增生李斯特杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌O157等均有抑制作用。其中对单核细胞增生李斯特杆菌、沙门菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用效果明显,对铜绿假单胞菌有微弱的抑制作用。结论通过基因工程获得的片球菌素Pediocin pa-1具有抑菌活性。

关键词：片球菌素pa-1 抑菌活性检测

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片球菌素pedA基因的原核表达、纯化及生物信息学分析

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生物技术通报 2017年第12期33卷 144-150页

作者：黄宇良汪立平陆克文邵会娟王正全上海海洋大学食品学院食品热加工工程技术研究中心上海201306 上海海洋大学食品学院上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306 上海邦成生物工程有限公司上海201506

旨在构建片球菌素pa-1结构基因pedA的原核表达载体,在大肠杆菌体系中实现pa-1的外源表达,运用生物信息学手段分析重组蛋白的理化性质及分子结构。以戊糖片球菌C-2-1的DNA为模板,扩增pedA基因,扩增产物克隆入pET28a(+)原核表达载体,构建p... 详细信息

旨在构建片球菌素pa-1结构基因pedA的原核表达载体,在大肠杆菌体系中实现pa-1的外源表达,运用生物信息学手段分析重组蛋白的理化性质及分子结构。以戊糖片球菌C-2-1的DNA为模板,扩增pedA基因,扩增产物克隆入pET28a(+)原核表达载体,构建pET28a-ped A重组质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3)中;30℃,以1 mmol/L IPTG诱导表达5 h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,检测纯化后重组蛋白的抑菌活性;利用生物信息学手段探究重组蛋白的理化性质及分子结构信息。结果显示,pET28a-ped A重组质粒构建成功,带有His标签的pa-1重组片球菌素在大肠杆菌中实现了可溶性表达,利用Ni-NTA亲和层析获得纯化的重组蛋白,Tricine-SDS-paGE电泳分析表明纯化后的重组蛋白分子量约为7.8 k D,与理论值相符。琼脂扩散法抑菌活性实验抑菌圈效果明显,表明纯化的重组片球菌素具有抑菌活性。生物信息学方法对比分析其蛋白结构发现,获得的重组蛋白含有信号肽,α螺旋占23.53%,疏水性提高,可能促进了重组蛋白的可溶性表达。该实验成功构建了片球菌素pa-1的原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的可溶性表达,该表达可能与其含有信号肽及信号肽疏水性有关,纯化后的重组蛋白抑菌活性明显。

关键词： pedA基因片球菌素pa-1 原核表达抑菌活性生物信息学

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