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一株印度洋深海食烷菌(Alcanivorax sp．P40)的烷烃羟化酶基因的克隆

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台湾海峡 2008年第2期27卷 141-146页

作者：赖其良袁军邵宗泽国家海洋局第三海洋研究所海洋生物遗传重点实验室福建厦门361005

以印度洋深层海水,用柴油和石油作为混合碳源经富集培养、分离获得一株具有很强的柴油降解能力的菌株P40.菌株P40革兰氏染色阴性,接触酶和氧化酶为阳性,能还原硝酸盐,不能还原亚硝酸盐.16S rDNA B lastn结果表明其与Alcanivorax dieselo... 详细信息

以印度洋深层海水,用柴油和石油作为混合碳源经富集培养、分离获得一株具有很强的柴油降解能力的菌株P40.菌株P40革兰氏染色阴性,接触酶和氧化酶为阳性,能还原硝酸盐,不能还原亚硝酸盐.16S rDNA B lastn结果表明其与Alcanivorax dieseloleiB-5T(柴油食烷菌)及***1A具有最高相似性,均为99.8%.菌株P40的gyrB序列与***1A同源性也高达99.2%,而与***-5T只有86.9%.此外,从菌株P40中克隆到两个烷烃羟化酶alkB基因片断,分别命名为P40a-lkB1和P40a-lkB2.其中P40a-lkB1与报道的***-5T中的alkB同源性较高,达96.3%,而与同为深海来源的菌株NO1A的alkB的同源性更是达100%,P40a-lkB2则与*** ensisSK2T(泊库岛食烷菌)的alkB1同源性最高,但仅为65%.

关键词：印度洋食烷菌烷烃羟化酶促旋酶 alkB gyrB

解烃菌TY22的解烃特性及其烷烃羟化酶基因的克隆

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解烃菌TY22的解烃特性及其烷烃羟化酶基因的克隆

作者：冀黎骏西华师范大学

学位级别：硕士

石油是目前全世界最为重要的能源物质,但在其开发和使用过程中,往往会泄漏或排放出大量石油烃污染物而造成严重的环境污染。随着污染情况日益加剧,高效且不产生二次污染的石油烃微生物修复技术现已成为该领域研究的热点,烷烃羟化酶作为... 详细信息

石油是目前全世界最为重要的能源物质,但在其开发和使用过程中,往往会泄漏或排放出大量石油烃污染物而造成严重的环境污染。随着污染情况日益加剧,高效且不产生二次污染的石油烃微生物修复技术现已成为该领域研究的热点,烷烃羟化酶作为启动整个降解过程的关键酶,也成为了研究的焦点。本研究以从南充炼油厂周围被石油污染的土壤中筛选出的一株高效石油烃降解菌TY22为研究对象,经鉴定,该菌株归属于Acinetobacter beijerinckii,最适生长温度和pH分别为30℃、7.0,能降解C1232的正构烷烃。由于微生物的生长和代谢与环境中的金属离子密切相关,本文研究了15种金属离子对TY22烷烃降解的影响。结果表明,低浓度的Na、Mg、K、Mn、Ca、Co、Cu、Zn对TY22菌株的生长和烷烃降解有一定的促进作用,但Ca、Co、Cu、Zn的促进作用较小,且当它们超过最适浓度后,菌体生物量快速减少;Fe、Ti对TY22菌株的生长和烷烃降解有一定的抑制作用,但低浓度的Fe对其影响不大,且当它们的浓度达到1 mmol/L时,菌株仍具有一定的生长潜力;Al、Pb对TY22菌株的生长和烷烃降解有很强的抑制作用,当其浓度达到0.8mmol/L时,菌体生物量已下降至0.1以下;Ba、Ag、Ni对TY22菌株的生长和烷烃降解有极强的抑制作用,当它们的浓度达到0.1 mmol/L(Ba达到0.4mmol/L)时,菌体生物量几乎为零。本文还研究了TY22菌株的烷烃羟化酶基因alkB。以TY22基因组DNA为模板,PCR扩增得到了TY22菌株烷烃羟化酶基因的部分序列。再通过染色体步移(Chromosome Walking)技术,最终获得了1236 bp的烷烃羟化酶基因完整CDS序列(GenBank Accession:KU867870)。经分析,该基因编码一段411 aa的蛋白,相对分子量46.7 kDa,等电点9.22。BLAST比对后发现,该序列与多株Acinetobacter beijerinckii的烷烃羟化酶氨基酸序列存在极高的同源性,最高可达99%。预测其二级结构包括37.47%的α螺旋,10.71%的β转角,35.28%的无规则卷曲和16.55%的延伸链。进一步将TY22的alkB基因与pET21b(+)载体构建重组质粒,并转入*** BL21(DE3)进行表达。结果发现,重组菌在0.1 mM IPTG、30℃条件下诱导培养6h的表达效果最佳,所得的46 kDa蛋白也与预期理论值相符。再将alkB基因克隆至pCom8载体中,并分别转入*** GEc137(pGEc47△B)和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1进行基因功能的互补试验。结果发现,TY22菌株的烷烃羟化酶能氧化C1216的中长链烷烃。

关键词：石油烃降解菌金属离子烷烃羟化酶表达功能互补

大西洋表层海水烷烃降解菌及其烷烃羟化酶CYP153A基因的多样性分析

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大西洋表层海水烷烃降解菌及其烷烃羟化酶CYP153A基因的多样性分析

作者：王丽萍国家海洋局第三海洋研究所

学位级别：硕士

当前,海洋的石油污染正在日趋加剧,对海洋环境和生态系统造成了长期和恶劣的影响。利用微生物的降解作用来主动清除溢油是当今非常重要的环境生物修复技术。因此,烷烃降解菌的分离、鉴定及其降解机制(烷烃羟化酶)的研究,无论是作为基础... 详细信息

当前,海洋的石油污染正在日趋加剧,对海洋环境和生态系统造成了长期和恶劣的影响。利用微生物的降解作用来主动清除溢油是当今非常重要的环境生物修复技术。因此,烷烃降解菌的分离、鉴定及其降解机制(烷烃羟化酶)的研究,无论是作为基础研究还是应用研究都有着非常重要的意义。本论文以柴油和原油混合物(1:1)为碳源,采用了单菌分离培养和DGGE相结合的方法研究了20个横跨大西洋的表层海水样品的石油降解菌组成。经过富集培养,从20个石油降解菌群中分离筛选得到197株不同细菌,分属于48个属,表现出了很高的种属丰度。降解菌群中可培养菌的16S rRNA基因系统发育分析表明,变形菌纲、放线菌类群、CFB类群以及厚壁菌门的细菌组成了该海域特定的微生物生态群落,其中尤以变形菌纲α和γ亚群数目居多。此外,还分离到了33株潜在的新种。PCR-DGGE分析表明,20个菌群中可培养优势降解菌为Alcanivorax、Thalasspospira、Marinobacter、Novosphingobium、Salinisphaera、Erythrobacter和Parvibaculum,未培养优势菌主要仍为Alcanivorax和Thalasspospir属菌,其次为Salinisphaera、Bortnella和Zymomona属菌等。单菌验证结果表明,大部分细菌都具有较好的柴油降解能力。其中,Salinisphaera属菌为潜在的新的烷烃降解菌。此外,Halomonas、Tistrella和Martelella属菌在这些菌群中也经常出现,但并不作为菌群的优势菌存在,单菌油降解能力都很弱。而Bortnella和Zymomona属菌虽然是菌群优势菌,但都未能获得纯培养。此外,还分离筛选得到1株能够很好降解C～C直链烷烃的Gordonia菌株S14-10,根据16S rRNA基因、看家基因secA1和生理生化特性初步确定其为该属的一个新种,同时还克隆分析其烷烃降解基因alkB和P450。通过设计简并引物,从19个属的68株细菌中扩增获得了87个烷烃羟化酶CYP153 P450基因片段。其中,12个属的细菌为首次发现含有P450基因,包括Bacillus、Brachybacterium、Halomonas、Idiomarina、Leifsonia、Martelella、Mesorhizobium、Ochrobactrum、Salinisphaera、Sphingobium、Tetrathiobacter、Tistrella以及Solimonas属。系统进化分析表明,这些P450序列多种多样,形成多个进化分枝,其中多数与Alcanivorax来源的P450同源性较高。Salinisphaera属菌里扩增到的P450基因较为新颖,在进化树上聚成了一个独立的小分支。此外,许多进化关系较远的菌株都扩增到了相同或者相近的P450基因,体现了基因的水平转移。再者,Parvibaculum、Erythrobacter、Sphingobium、Tistrella、Bacillus属的10株菌还发现了存在多个P450基因。本文还对分离自不同海域的11株Parvibaculum属细菌,以16S rRNA、看家基因rpoD以及重复PCR为基础进行了系统的分析比较,结果发现一些16S rRNA和rpoD序列相近的菌株其重复PCR带型差异较大,说明了重复PCR技术的可靠性与灵敏性,同时也反映了其生境不同而造成的进化上的差异。此外,本文对该属11株菌的CYP153 P450基因PCR产物进行克隆文库分析,发现每株菌都包含4～6个P450序列。实时荧光定量PCR分析表明,菌株Parvibaculum sp.S18-4的6个P450基因中只有P450-2和P450-4能在C和C烷烃诱导下上调表达,其它基因不表达或下调表达。它们是否编码有功能的烷烃羟化酶、是否负责其它底物的降解还有待下一步实验验证。本论文对横跨大西洋的表层海水样品中的20个石油降解菌群进行了系统的研究,获得了丰富的石油烃降解微生物以及降解基因资源。这些结果有助于我们了解石油在海洋环境中的归宿,也为进一步开发治理海洋石油污染的生物修复制剂以及开展降解机制研究与基因利用提供了宝贵的材料。

关键词：大西洋表层海水海洋石油污染石油降解菌烷烃羟化酶

印度洋表层海水石油降解菌及其烷烃羟化酶AlkB的多样性分析

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印度洋表层海水石油降解菌及其烷烃羟化酶AlkB的多样性分析

作者：刘阳华中农业大学

学位级别：硕士

目前,随着海洋石油开采和石油运输的快速发展,石油渗漏和溢油事故频繁发生,由此产生的海洋石油污染给海洋环境和海洋生态系统造成了严重的影响。而利用微生物的降解作用来减少和清除海洋石油污染成为生物修复中重要的方法。因此,对石油... 详细信息

目前,随着海洋石油开采和石油运输的快速发展,石油渗漏和溢油事故频繁发生,由此产生的海洋石油污染给海洋环境和海洋生态系统造成了严重的影响。而利用微生物的降解作用来减少和清除海洋石油污染成为生物修复中重要的方法。因此,对石油降解菌的分离、鉴定及其石油降解关键酶(烷烃羟化酶)的研究,一方面具有重要的理论意义,另一方面具有潜在的应用价值。本试验以22个印度洋的表层海水为研究对象,用原油和柴油混合物(体积比1：1)作为唯一的碳源和能源进行富集,研究石油降解菌及其烷烃羟化酶的多样性。首先,本研究利用平板涂布法研究石油降解菌群中可培养菌的多样性。结果表明：12个降解菌群的优势类群为细菌,而剩余10个降解菌群的优势类群为酵母菌。12个降解菌群中共分离到91株细菌,它们归属于19个属,30个种。基于16S rRNA基因的系统发育分析表明：在91株菌中,多数属于Alaphaproteobacteria (40.66%)、 Gammaproteobacteria(35.16%)和Actinobacteria(17.58%),少数属于Firmicutes(5.49%)和Bacteroidetes (1.1%);优势属为Alcanivorax、Salinicola、Marinobacter、 Novosphingobium、Thalassospira和Microbacterium等。这表明印度洋表层海水中可培养石油降解菌的多样性丰富。同时,7菌细菌,2株酵母菌Yarrowia lipolytica和Pichia sp和部分菌群具有显著的石油降解效果,因此具有潜在的应用价值。其次,本研究利用454焦磷酸测序的方法分析了石油降解菌群中细菌的多样性。结果表明：12个降解菌群包含7个纲的菌株,其中优势类群为Alaphaproteobacteria(37.10%)和Gammaproteobacteria (61.67%);在属水平上,12个降解菌群包含58个属,优势属依次为Alcanivorax (37.03%)、Thalassospira (18.50%)、Marinobacter (13.77%)、Novosphingobium (11.90%)、Parvibaculum (4.86%)、Salinicola (2.74%)、 Cobetia (2.63%)、Pseudomonas (2.60%)和Pseudoalteromonas (1.41%)等。同时,12个降解菌群中还存在许多丰富度较低的类群,如Muricauda、Achromobacter、 Idiomarina和Rhodococcus等,它们在石油降解过程中的地位和作用有待于进一步研究。另外,12个石油降解菌群的相似度分析和主成分分析表明：不同菌群结构的相似性与采样地点没有一定的分布规律。最后,本研究利用克隆文库的方法研究石油降解菌群中烷烃羟化酶的多样性。从12个降解菌群中共获得463个阳性克隆子,以氨基酸相似度80%作为划分OPU的标准,463个克隆子共划分为11个OPUs。其中优势的OPUs为OPU1(44.71%)和OPU2(39.52%),与其同源性最高的序列分别为Alcanivorax sp. S17-16(ACJ22719)和Uncultured bacterium KL2c09(AFC90113),后者为Marinobacter,这与454焦磷酸高通量测序的优势菌株一致;OPU11与最高同源性序列的相似性仅为66.06%,为新颖的烷烃羟化酶AlkB序列。烷烃羟化酶AlkB的系统发育分析表明：烷烃羟化酶AlkB不但分布广泛,而且多样性丰富。本文对22个石油富集的降解菌群进行了系统的研究,获得了丰富的石油降解菌株和降解关键基因。这不但有助于更加深入的了解海洋表层海水中石油降解菌的分布和多样性,而且也为后续石油污染的生物修复提供了宝贵的菌株资源和基因资源。

关键词：印度洋表层海水石油污染 454高通量测序酵母菌烷烃羟化酶

一株石油烃降解菌TY22烷烃羟化酶基因的克隆及功能研究

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安徽农业科学 2017年第36期45卷 131-134,153页

作者：唐赟敬珊邹书珍冀黎骏杨雪余小丽西华师范大学生命科学学院四川南充637009

[目的]对一株石油烃降解菌TY22的烷烃羟化酶基因alkB克隆测序,并对其外源表达和功能进行研究。[方法]PCR扩增获得alkB基因部分序列,再根据该序列通过染色体步移技术,最终获得完整CDS序列。将alkB基因与pET21b(+)载体构建重组质粒,并转入... 详细信息

[目的]对一株石油烃降解菌TY22的烷烃羟化酶基因alkB克隆测序,并对其外源表达和功能进行研究。[方法]PCR扩增获得alkB基因部分序列,再根据该序列通过染色体步移技术,最终获得完整CDS序列。将alkB基因与pET21b(+)载体构建重组质粒,并转入*** BL21(DE3)进行表达。再将alkB基因克隆至pCom8载体中,分别转入*** GEc137(p GEc47△B)和Pseudomonas fluorescens KOB2Δ1进行基因功能的互补试验。[结果]染色体步移获得了1 236 bp的烷烃羟化酶基因完整CDS序列(Gen Bank Accession:KU867870)。诱导表达发现,重组菌在0.1 mmol/L IPTG、30℃条件下诱导培养6 h的表达效果最佳,得到与预期相符的46 kDa蛋白。基因功能互补试验发现,重组菌能在以C12~C16为唯一碳源的培养基中生长。[结论]TY22菌株的烷烃羟化酶基因完整CDS序列全长1 236 bp,能氧化C12~C16的中长链烷烃,并能在大肠杆菌中有效表达。

关键词：石油烃降解菌烷烃羟化酶表达功能

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高效耐盐柴油降解菌的筛选、鉴定及降解基因

中国环境科学 2017年第11期37卷 4251-4258页

作者：胡春辉于浩赵阳国田伟君白洁中国海洋大学环境科学与工程学院海洋环境与生态教育部重点实验室山东青岛266100 青岛农业大学生命科学学院山东青岛266109

在辽河口湿地油田石油污染土壤中分离到一株耐盐柴油高效降解菌株L7,经过形态学观察、16S r RNA基因序列分析鉴定菌株L7属于不动杆菌属(Acinetobacter).该菌株能够以柴油、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷和二十二烷为... 详细信息

在辽河口湿地油田石油污染土壤中分离到一株耐盐柴油高效降解菌株L7,经过形态学观察、16S r RNA基因序列分析鉴定菌株L7属于不动杆菌属(Acinetobacter).该菌株能够以柴油、十五烷、十六烷、十七烷、十八烷、十九烷、二十烷和二十二烷为唯一碳源和能源生长.在柴油无机盐培养基中,菌株的最适生长温度为30°C,最适pH值为7.0,菌株L7在pH 6.0~9.0,盐度范围为3%以内都可以生长.与其他的菌株相比较,菌株L7在柴油中生长更加迅速,在最适培养条件下培养4d后菌株的OD600nm就可以达到4.0,通过紫外分光光度法测定培养5d后,柴油的降解效率为61.5%.通过对菌株L7的全基因组测序和分析,在基因组上找到一个烷烃羟化酶基因alk B,将基因克隆到p ME6032质粒上,并电转至不依赖柴油生长的恶臭假单胞菌KT2440中,含有该质粒的KT2440菌株能够在柴油无机盐培养基中生长.GC-MS检测确定了菌株L7及其alk B基因对饱和烷烃的降解能力.推测菌株L7中烷烃降解途径为末端氧化途径,是由烷烃羟化酶催化反应生成相应的醇,最终通过β-氧化反应实现完全矿化.

关键词：不动杆菌柴油烷烃羟化酶生物降解

高效石油烃降解菌不动杆菌(Acinetobacter ***-15)的筛选、鉴定及其降解性能研究

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中国科学：生命科学 2016年第9期46卷 1091-1100页

作者：刘玉华胡晓珂中国科学院烟台海岸带研究所海岸带生物学与生物资源利用重点实验室烟台264003 中国科学院大学北京100049

本研究旨在从土壤中筛选高效石油烃降解菌株，并对其系统分类和降解特性进行研究，为石油污染的原位修复奠定基础．该研究从滨州油井溢油污染土壤样品中分离得到一株高效石油烃降解菌株BZ-15，对菌株BZ-15进行形态观察、16SrRNA基因序... 详细信息

本研究旨在从土壤中筛选高效石油烃降解菌株，并对其系统分类和降解特性进行研究，为石油污染的原位修复奠定基础．该研究从滨州油井溢油污染土壤样品中分离得到一株高效石油烃降解菌株BZ-15，对菌株BZ-15进行形态观察、16SrRNA基因序列分析及系统发育树分析；对该菌株的生长特性进行研究；通过GC-MS分析其对原油组分中不同碳原子饱和烃的降解特性；同时研究吐温．20对其生长及降解特性的影响；对该菌株中的烷烃羟化酶基因alkM进行了克隆．结果表明，菌株BZ-15为不动杆菌属（Acinetobactersp．）细菌，在LB培养基中其代时为3．25h，添加吐温．20代时为2．67h，吐温．20可促进菌株BZ．15生长；该菌株可降解C13-c28碳链长度饱和烃，饱和烃降解率为61．O％，添加吐温．20饱和烃降解效率为52-2％，吐温．20可抑制菌株BZ-15降解饱和烃；菌株BZ-15存在烷烃羟化酶基因alkM，通过末端氧化途径对饱和烃进行降解．

关键词：不动杆菌石油烃烷烃羟化酶吐温-20

海洋烷烃降解菌Alcanivorax sp．A-11-3的分离鉴定及其降解酶基因研究

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台湾海峡 2008年第4期27卷 427-434页

作者：吴业辉邵宗泽厦门大学生命科学学院福建厦门361005 国家海洋局第三海洋研究所国家海洋局海洋生物遗传重点实验室福建厦门361005 国家海洋局第三海洋研究所国家海洋局海洋生物遗传重点实验室福建厦门361005

从马六岬海峡的表层海水中分离到一株石油降解菌A-1l-3．经16SrDNA Blast结果表明其与Alcanivorax borkumensisSK2具有最高相似性为96％，该菌可能是食烷菌属的一个新种．该菌具有很强的石油降解能力．结果表明，A—11—3对烷烃的降解... 详细信息

从马六岬海峡的表层海水中分离到一株石油降解菌A-1l-3．经16SrDNA Blast结果表明其与Alcanivorax borkumensisSK2具有最高相似性为96％，该菌可能是食烷菌属的一个新种．该菌具有很强的石油降解能力．结果表明，A—11—3对烷烃的降解范围较宽，能以C8～C36的烷烃为唯一碳源和能源生长；在7d内该菌对柴油的降解率达到49．5％．此外，还从菌株中克隆到了大小为426bp的烷烃羟化酶基因alkB片段和843bp的P450烷烃羟化酶基因的部分序列．序列分析表明，alkB片段编码的氨基酸序列与4．60rkumensis SK2^T的AlkB1和AlkB2的同源性分别为57．75％和40．14％；该菌的P450与SK2菌株的P450具有最高同源性，为87％．研究结果对于海洋石油降解微生物生态研究及石油污染生物修复技术开发有参考价值．

关键词：食烷菌石油降解菌烷烃羟化酶马六岬海峡

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生物技术文摘

中国医药工业杂志 2014年第12期 1134-1134页

作者：许俊

B45-37利用固定化汉逊德巴利酵母在气升式生物反应器中补料分批培养生产木糖醇Pérez-Bibbins B等[Appl Microbiol Biotechnol,2014,98:151]本研究使用固定化于藻酸钙上的汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii),在气升式生物反应器中... 详细信息

B45-37利用固定化汉逊德巴利酵母在气升式生物反应器中补料分批培养生产木糖醇Pérez-Bibbins B等[Appl Microbiol Biotechnol,2014,98:151]本研究使用固定化于藻酸钙上的汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii),在气升式生物反应器中生产木糖醇,通过补料分批培养避免底物抑制。结果表明气升式生物反应器是一个合适的系统,因为流体化需要的最小空气流量甚至低于

关键词：烷烃羟化酶木糖醇 CYP 迪茨补料固定化基因气升式生物反应器