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烯键还原酶的固定化与应用研究

烯键还原酶的固定化与应用研究

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作者：李函吉林大学

学位级别：硕士

烯键还原酶(enoate reductases,ERs)是一种具有潜在应用价值的酶类,属于“老黄酶”家族(“old yellow enzyme”family),广泛分布于微生物和植物中。它能够选择性地还原α,β-不饱和化合物中的碳碳双键,如不饱和醛、酮、硝基烯及其衍生物... 详细信息

烯键还原酶(enoate reductases,ERs)是一种具有潜在应用价值的酶类,属于“老黄酶”家族(“old yellow enzyme”family),广泛分布于微生物和植物中。它能够选择性地还原α,β-不饱和化合物中的碳碳双键,如不饱和醛、酮、硝基烯及其衍生物,催化得到的饱和醛、酮等化合物是农药、食品添加剂和医药的关键中间体。虽然利用ER催化反应具有环境污染少和反应条件温和等优势,但应用中存在一些的问题,如ER在催化反应中消耗昂贵的辅酶和酶较差的稳定性等。针对以上问题,本论文利用三种不同的固定化方法实现了催化反应中的辅酶循环再生,并显著提高了ER的稳定性,它们分别是交联酶聚集体(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)、仿生固定化(biomimetic immobilization,BI)和纤维素载体共价固定化(cellulose covalent immobilization,CCI)。在交联酶聚集体共固定化酶(ER-GDH-CLEAs)的制备过程中,优化的最佳条件分别是:沉淀剂硫酸铵浓度为4 M、交联剂葡聚醛浓度为15%(v/v)、ER和葡萄糖脱氢酶(GDH)的酶量是11 U和50 U。在此制备条件下,ER-GDH-CLEAs的固定化效率是94.2%,其中ER和GDH的活力回收率分别为44.1%和18.8%。不同条件制备的ER-GDH-CLEAs在扫描电镜(SEM)中显示出不同的结构特征。SEM显示使用葡聚醛相比戊二醛,制得的固定化酶具有多孔性,添加牛血清白蛋白(BSA)进一步增加了这种趋势。结合实验数据发现多孔性的结构可能更加利于底物与酶接触。固定化酶的热稳定性显著提高,如50℃热处理8 h后,ER-GDH-CLEAs中ER相对初始活力保持65.2%,而游离酶仅9.2%。此外,ER-GDH-CLEAs的重复使用性表现十分优异,经过14次重复使用后仍保留114%的相对活力,高于100%的原因可能是酶蛋白在使用中,蛋白的空间构象发生了变化。在仿生共固定化酶(ER-GDH-SPs)的制备过程中,优化的最佳条件分别是:前驱体原硅酸四甲酯(TMOS)浓度为1 M、缓冲液是磷酸缓冲液(50 mM,pH 7.0)、固定化时间为2 h、ER和GDH的酶量是14 U和50 U。在此制备条件下,ER-GDH-SPs的固定化效率是94.7%,其中ER和GDH的活力回收率分别为44.7%和22.3%。SEM显示ER-GDH-SPs为颗粒状的聚集体,结合实验数据(固定化效率高于94%等)推断酶蛋白被包埋其中。由于酶蛋白覆有纳米氧化硅外层而获得优异的稳定性。如50℃热处理8 h后,ER-GDH-SPs中ER保持55.4%的相对活力,而游离酶的活力几乎完全丧失。在重复使用性方面,ER-GDH-SPs经过6次使用后保持近100%的相对活力。在制备纤维素载体共价固定化酶的过程中,优化的最适条件分别是:使用深共熔溶剂(DESs)预处理木质纤维素,并用高碘酸钠、乙二胺(300 mM)和戊二醛(100 mM)对纤维素进行表面修饰,酶的固定化中ER用量为30 mg,缓冲液为Tris-HCl(50 mM,pH 7.5),固定化时间是2 h。在此制备条件下,ER-CCI的固定化效率为95.5%,活力回收率达到47.5%。结合SEM图像,说明预处理后的木质纤维素因为溶解去除了大部分木质素,表面由光滑变得粗糙并有许多孔隙。进一步修饰后,蛋白与载体进行结合,并获得优异的热稳定性。如50℃下热处理8 h后,游离酶的活力减少了91%,而ER-CCI仍保留82.3%。另外,固定化酶在重复使用性上表现较好,8次重复使用后剩余80%的相对活力。为了验证固定化方法的有效性,进行了固定化酶催化的连续反应实验。利用催化还原4-(4-甲氧苯基)-3-丁烯-2-酮的反应作为模型反应,进行了固定化酶对底物的连续转化反应。反应期间添加5次底物(100μM)和1次NAD(100μM)。在ER催化的氧化还原反应中,辅酶与底物消耗量的摩尔比为2:1。因为每次添加底物的浓度为100μM,理想状态下反应的产物浓度为50μM。实际上,在ER-GDH-SPs、ER-GDH-CLEAs和纤维素共价固定化酶的催化体系中,最终获得产物的浓度分别为215μM、155μM和105μM,约为理想状态下产物浓度的4倍、3倍和2倍,实验数据说明固定化酶催化反应中的辅酶循环再生的效果良好。总之,三种固定化方法制备的ER固定化酶的固定化效率都高于94%,虽然活力回收率较低(约45%),但与其它类型氧化还原酶类固定化相关报道的数据处于同一水平。目前,ER的固定化制备未见文献报道。

关键词：烯键还原酶共固定化辅酶循环再生连续催化

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烯键还原酶的研究及应用

烯键还原酶的研究及应用

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作者：李小芳北京化工大学

学位级别：硕士

生物催化（biocatalysis）是指利用酶、微生物细胞或者动植物细胞作为催化剂催化化学反应的过程。与化学催化剂相比,生物催化剂具有很多优点,如:反应条件温和、催化效率高、副产物少等。生物催化符合当今时代绿色发展的要求,将会具有更... 详细信息

生物催化（biocatalysis）是指利用酶、微生物细胞或者动植物细胞作为催化剂催化化学反应的过程。与化学催化剂相比,生物催化剂具有很多优点,如:反应条件温和、催化效率高、副产物少等。生物催化符合当今时代绿色发展的要求,将会具有更广阔的应用范围和更光明的发展前景。己二酸常用作合成尼龙6.6的中间体,是最重要的二元羧酸之一。据估计到2022年时,全球的己二酸市场将达到80亿磅,因此己二酸具有的商业价值不容小觑。目前生产己二酸普遍还是通过石油化工路线,如硝酸催化KA油（环己醇/环己酮混合物）的氧化进行化学合成,在合成过程中会产生大量的N2O,其造成的温室气候影响比CO2高298倍。己二酸生产造成的N2O排放占工业总N2O排放的80%左右,其工业减排潜力约占96.2%,使用绿色可再生原料生产己二酸可以有效地降低生产过程所带来的环境污染。由于没有可靠的天然的合成途径,需要以基因工程和代谢工程的手段整合外源基因从而构建生物法合成己二酸途径,但是到目前为止利用生物法合成己二酸在经济上看仍然是不可行的。对于构建热力学可行且经济可行的绿色生物己二酸途径还需要更多的努力。现已构建的己二酸生物合成途径大多数会涉及到烯己二酸的碳碳双键还原,故而烯键还原酶的催化活性是影响生物法合成己二酸工业化的重要因素。烯键还原酶（Enoate reductase,ERs,EC 1.***.1.31）能催化共轭的C=C双键的立体选择性的加氢反应,产生含有多达两个新的手性中心的化合物,是生物催化合成的重要酶类之一。本课题研究对象为己二酸生物合成途径中所需的来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans的烯键还原酶（ER-BC）,旨在通过定向进化提高其催化活性并深入研究其催化机理等酶学性质。（1）来源于凝结芽孢杆菌的烯键还原酶ER-BC没有己报道的晶体结构,不具备直接进行定点突变的条件,以易错PCR构建的随机突变文库为基础,经96孔板初筛及摇瓶发酵复筛,获得2株（分别命名为ER-BC-7、ER-BC-15）酶活明显提高（酶的比活力提高7倍）的菌株,其中 ER-BC-7 具有四个突变位点Leu181Pro/Ile187Asn/Phe207Tyr/Phe229Ile,ER-BC-15 具有两个突变位点 Gly 111 Asp/Gly531 Ser。（2）借助计算机辅助,使用穿线法——I-ATSSER预测服务器建模得到ER-BC结构。利用穿线法构建的ER-BC模型与底物2-烯-1,6-己二酸通过autodock4进行分子对接,对接结果显示底物与Va161、His71和Tyr180形成了氢键作用,配体FMN处在底物与活性位点的附近,但其与底物具有一定距离,Tyr180与底物的羧基O-能够形成氢键,为烯键还原酶ER-BC的定点突变奠定了实验基础。（3）综合文献所得信息及随机突变、同源建模结果,共设计21种突变体蛋白,最终得到酶活提高12倍的突变体蛋白G111D+L181P。综合以上实验结果提出了 ER-BC的催化机理:首先由辅酶FMN向底物的β-C传递第一个H+（限速步骤）;随后180TYR为底物的α-C提供第二个H+,完成双键的还原,由任意残基与底物形成氢键以稳定结合。（4）对野生型烯键还原酶ER-BC及其酶活提高的的突变体蛋白的酶学性质如最适反应温度、最适反应pH、耐氧性及动力学参数进行了测定。测定结果显示突变体蛋白S109N+G111D+L181P与G111D+L181P的Km/Kcat与野生型ER-BC相比分别提高了 9倍、14倍。

关键词：生物催化己二酸烯键还原酶定向进化

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烯键还原酶的表达及应用研究

烯键还原酶的表达及应用研究

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作者：肖文华吉林大学

学位级别：硕士

在生物催化领域，高效催化的酶对催化反应的进行是至关重要的。烯键还原酶（enoate reductases，ERs）作为一类受到广泛关注的新型酶，能够高选择性地还原碳碳双键，近年来对其高效催化酶源的研究成为热点。带有吸电子基团的饱和化合... 详细信息

在生物催化领域，高效催化的酶对催化反应的进行是至关重要的。烯键还原酶（enoate reductases，ERs）作为一类受到广泛关注的新型酶，能够高选择性地还原碳碳双键，近年来对其高效催化酶源的研究成为热点。带有吸电子基团的饱和化合物是医药、激素、香料、以及农药生产等方面的重要物质，常常需要由其α，β-不饱和化合物选择性还原获得，但吸电子基团易使烯烃钝化，对其进行选择性还原是一个富有挑战性的课题。化学合成中最常用过渡金属及其络合物对该类化合物还原，此法存在成本高，条件苛刻，产率低、会污染环境等缺点。研究表明，生物界中的烯键还原酶能够还原碳碳双键，且选择性高，产率好，条件温和，是一条环境友好的合成途径。目前对于能够进行高效催化的烯键还原酶种类研究还很少，几乎没有可以用于工业生产应用的。本文对来自枯草杆菌的烯键还原酶基因进行表达纯化，并将其应用于一系列底物催化。烯键还原酶催化过程中需要昂贵的辅酶NAD(P)H的参与，为解决这一问题对辅酶再生体系进行了研究。同时，首创对烯键还原酶固定化方面的研究。一、烯键还原酶的克隆表达从枯草杆菌中获得的烯键还原酶基因BS1K成功在大肠杆菌BLP中表达。诱导条件为：IPTG终浓度为0.2mM，25℃，120rpm震荡12h。将可溶表达的目的蛋白镍柱纯化，最适的咪唑洗脱浓度为80mM。二、烯键还原酶催化反应将纯化的BS1K用于依赖于NADH的催化反应，底物类型范围包括：α,β-不饱和羰基、羧酸、酯、硝基与硝基醇化合物。BS1K对于不饱和羰基化合物的具有良好的区域选择还原催化效力。以4-甲氧基苯丁烯酮为模型确定最佳催化条件：7.5mg/mL酶浓度，11mg/mL NADH添加量，Na2HPO4-柠檬醛作为缓冲液，10mM底物浓度。在此条件下，转化率达到＞99%。该重组酶对于α,β-不饱和硝基和硝基醇也具有还原能力。其中，1-溴-4-(2-硝基乙烯)苯在PBS缓冲液中的转化率比Tris-HCl中的要高，达到37%。该酶对带有一个吸电子基团的不饱和酸和酯开链化合物不具备催化能力。烯键还原酶成功对α，β-不饱和硝基和硝基醇类的前手性化合物进行催化，生成的产物中，手性碳位于α处时生成的是消旋体，位于β处的产物具有较好的对映体选择性（81%）。三、辅酶再生研究本文采用以NAD+/GDH的辅酶再生体系催化反应，经过结果比较，辅酶再生体系的转化速率大于NADH参与的催化，后者大于菌体催化的反应。另外，辅酶再生体系还能催化NADH单独作为辅酶时不能催化的（1-硝基-1-烯-2-甲基）苯。四、烯键还原酶固定化利用无载体的固定化技术-交联酶聚集体（CLEAs）技术对烯键还原酶进行固定化实验。实验分为两部分：单酶固定化和双酶固定化。单酶固定化是对重组烯键还原酶BS1K的固定化实验。经过沉淀和交联两个步骤条件的优化，最终得到活力回收为39%的固定化酶。优化的固定化条件为：3.5M的硫酸铵作为沉淀剂沉淀45min，4%（v/v)戊二醛作为交联剂交联3h。将固定化酶进行7次重复利用实验后，酶活残留81.4%。双酶固定化是对BS1K和GDH的共固定化。固定化条件条件：7M的硫酸铵作为沉淀剂沉淀2h，3%（v/v)戊二醛作为交联剂交联3h，得到活力回收率BS1K为45.7%，GDH为4.25%。7次重复使用后，酶活残留76%。本实验成功表达烯键还原酶BS1K，该酶在对一系列底物的催化中展示出了优良的催化效力，首次对其进行固定化实验，为以后的手性化合物合成和工业大规模应用提供新的研究思路。

关键词：烯键还原酶碳碳双键还原固定化辅酶再生

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生物催化立体选择性MBH反应的研究

生物催化立体选择性MBH反应的研究

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作者：崔秀梅吉林大学

学位级别：硕士

森田-贝利斯-希尔曼反应(MBH反应)是重要的碳-碳键形成反应,在过去的几十年中,MBH产物已经引起了人们的广泛关注,它可以作为含有烯基丙醇的复杂天然产物的有价值的组成部分。在传统的化学催化中存在环境污染,反应条件复杂等问题。目前... 详细信息

森田-贝利斯-希尔曼反应(MBH反应)是重要的碳-碳键形成反应,在过去的几十年中,MBH产物已经引起了人们的广泛关注,它可以作为含有烯基丙醇的复杂天然产物的有价值的组成部分。在传统的化学催化中存在环境污染,反应条件复杂等问题。目前关于酶催化MBH反应的报道普遍存在催化效率不高的情况。本文使用酯酶、丙氨酸消旋酶、烯键还原酶催化MBH反应。我们主要以硝基苯甲醛和环己烯酮为底物,磷酸缓冲液为溶剂的条件下催化MBH反应。经过对三种酶催化的几个重要的参数进行优化,发现ER具有较好的催化效果。随后引入添加剂辅助ER催化MBH反应,并制备ER突变体期望进一步提高酶的催化效果。我们对酯酶和丙氨酸消旋酶进行克隆表达和蛋白纯化。从枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis168)基因组中获得酯酶yitV、丙氨酸消旋酶基因alr1,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达相应蛋白。yitV最佳诱导温度为16℃,IPTG终浓度0.01 mM,alr1最佳诱导温度为25℃,IPTG终浓度0.1 mM。蛋白经过镍柱纯化后得到纯的alr1、yitV。将构建成功的yitV、alr1和ER用于催化MBH反应中。从反应结果来看,yitV、alr1、ER三种不同类型的酶都可以催化MBH反应。这三种酶催化产生的MBH产物的最优产率分别为32.5%、29.4%、36.0%,Aldol产物的产率为28.5%、28.7%、30.1%,ee值分别为6.0%、2.1%、6.5%。随后引入四种不同类型的添加剂辅助ER和制备ER突变体催化MBH反应,根据实验结果发现氨水和小分子醇对催化该反应有一定的促进作用。制备ER突变体催化MBH反应。ER表面的28位酪氨酸突变为组氨酸,315位苯丙氨酸变为丝氨酸,195位的精氨酸变为丝氨酸,12位赖氨酸突变为异亮氨基酸,215位的精氨酸变为丝氨酸。ER内部的51位甘氨酸突变为丝氨酸。将这些制备的突变体表达蛋白并纯化分别催化该反应。结果发现位于ER表面的12位Lys和215位Arg突变为其它氨基酸,MBH产物的产率降低了10.0%左右,其它氨基酸突变体则没有明显的变化。位于ER蛋白表面的Lys和Arg发生变化,MBH产物的产率明显的降低,由此我们猜测位于蛋白表面的Lys和Arg可能促进了MBH反应的发生。根据这一现象,使用单个氨基酸催化MBH反应,发现除酸性氨基酸以外都可以使得MBH反应发生,同时生成有较多的Aldol产物。L-Lys、L-Arg、L-His这三种碱性氨基酸催化MBH反应,其中L-Lys催化该反应生成的MBH产物产率为46.9%,ee值为5.8%,Aldol产物产率为36.8%,L-His催化该反应生成的MBH产物产率为29.2%,ee值为2.1%,Aldol产物产率为12.4%。根据实验结果来看,L-Lys催化效果明显好于L-His催化该反应。可能在酶催化该反应中赖氨酸起到了更好的作用。使用L-Gly、L-Ala、L-Pro这三种非极性氨基酸催化该反应生成的MBH产物产率分别为43.0%、43.7%、19.9%,生成MBH产物的ee值分别为0.9%、15.1%(S型)、51.0%。L-Gly和L-Ala偏向于促使MBH产物的生成,L-Pro偏向于提高MBH产物的立体选择性。L-Ser和L-Trp这两种极性氨基酸催化效果没有明显的优势。本论文通过烯键还原酶、丙氨酸消旋酶、酯酶催化MBH反应,我们拓展了烯键还原酶、丙氨酸消旋酶、酯酶在催化反应中的应用,为催化MBH反应提供更多的酶源。引入添加剂和制备ER突变体提高酶的催化效果为催化该反应提供更多的方法。使用氨基酸催化MBH反应为提高MBH产物产率提供一种新的路径。

关键词：丙氨酸消旋酶酯酶烯键还原酶 MBH反应

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生物催化柠檬醛合成（R）-香茅醛的研究

生物催化柠檬醛合成（R）-香茅醛的研究

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作者：郑联丹华东理工大学

学位级别：硕士

香茅醛,即3,7-二甲基-6-辛烯醛,分子中含有一个手性碳原子,因而具有(R)和(S)两种构型。香茅醛具有强烈的青柑橘和微带木香的香气,因而被广泛用于食品的加香和配制,其中,(R)-香茅醛是合成重要香料L-薄荷醇的关键前体。目前,工业上主要采... 详细信息

香茅醛,即3,7-二甲基-6-辛烯醛,分子中含有一个手性碳原子,因而具有(R)和(S)两种构型。香茅醛具有强烈的青柑橘和微带木香的香气,因而被广泛用于食品的加香和配制,其中,(R)-香茅醛是合成重要香料L-薄荷醇的关键前体。目前,工业上主要采用化学催化方法合成(R)-香茅醛,如日本高砂(Takasago)公司发明的手性BINAP-Rh+配位催化剂不对称催化香叶基胺合成(R)-香茅醛,以及德国巴斯夫(BASF)公司发明的(Z)-柠檬醛的选择性氢化。前者催化剂的制备条件苛刻且回收利用困难,后者需要通过精馏(E/Z)-柠檬醛获得高纯度的(Z)-柠檬醛,且使用了含重金属的特制合成催化剂。相比于化学催化,烯键还原酶催化柠檬醛不对称还原合成香茅醛的方法具有环境友好、反应条件温和、产物立体选择性高等优点。但是,目前报道的能够高选择性、高活性催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛的烯键还原酶非常少,大部分的烯键还原酶催化柠檬醛时倾向于生成(S)-香茅醛。本论文以构建高效的(R)-香茅醛生物合成体系为目标,筛选能够高选择性催化(E/Z)-柠檬醛生成(R)-香茅醛的烯键还原酶,并对其进行酶学性质研究;针对目前全细胞催化过程中的副反应问题,构建合适的细胞催化剂和全细胞催化反应体系。具体研究内容如下:一、对柠檬醛具有(R)-对映体选择性的烯键还原酶的筛选及其酶学性质研究以天然的(E/Z)-柠檬醛(反式:顺式=9:10)为底物,从23个不同来源的烯键还原酶中,筛选到来源于Saccharomyces cerevisiae YJM1341的NAD(P)H依赖的烯键还原酶OYE2p,展现出最高的对映体选择性(84.5%)。酶学性质研究表明,OYE2p的最适温度为40 ℃,最适pH为7.5,在30 ℃以下和偏碱性(pH 7-9)环境中较稳定。通过对其底物谱的研究发现,OYE2p对于碳碳双键附近带有两个吸电子基团的化合物如马来酰亚胺、N-苯基马来酰亚胺、茶香酮以及马来酸二甲酯具有很高的酶活。二、烯键还原酶OYE2p催化柠檬醛的对映体选择性的影响因素和酶催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛的研究对于柠檬醛的两种异构体,OYE2p对(E)-柠檬醛(顺式,香叶醛)和(Z)-柠檬醛(反式,橙花醛)表现出不同的对映体选择性。OYE2p对(E)-柠檬醛(顺式,香叶醛)表现出严格的(R)-对映体选择性,产物(R)-香茅醛的ee值>99%,且不受环境pH的影响;OYE2p催化橙花醛时倾向于生成(R)-香茅醛,但也生成(S)-香茅醛,而且产物的eeR随着pH值的增大而增大。对于(E)、(Z)-柠檬醛,OYE2p在pH7.6条件下表现最高的催化活性。基于上述结果,伴随葡萄糖脱氢酶催化的辅酶NAD(P)H再生反应,利用OYE2p催化200 mM香叶醛合成了光学纯的(R)-香茅醛,产物ee值为98%(R),底物转化率为大于99%,产率为87.03%;当以200 mM的(E/Z)-柠檬醛作为底物时,产物的ee值为89%(R),底物转化率为98.4%,产率为87.2%。三、OYE2p与甲酸脱氢酶(FDH)的共表达及全细胞催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛的研究考虑到辅酶循环的复杂性、酶的稳定性和制备成本等问题,构建OYE2p和FDH(催化辅酶NADH再生)共表达的***细胞催化剂,采用全细胞催化(E/Z)-柠檬醛合成(R)-香茅醛。研究发现,重组***全细胞催化柠檬醛的反应过程中,在柠檬醛分子上的碳碳双键被还原生成香茅醛的同时,柠檬醛和生成的香茅醛分子上的醛基还会被细胞内竞争性的NAD(P)H依赖的羰基还原酶还原为香叶醇、橙花醇、香茅醇等副产物;此外,生成的香茅醛也会被进一步降解或代谢。本研究选择了 2种不同的连接肽,构建了 2种OYE2p与FDH融合表达的***细胞催化剂。其中,融合表达菌***(pET21d-fdh-(ggggs)3-oye2p)中融合蛋白的表达量以及OYE2p、FDH的酶活力最高。有趣的是,利用该菌全细胞催化柠檬醛过程中没有羰基还原副反应的发生。主要原因是,融合表达加强了 OYE2p与FDH的空间临近效应,使辅酶在二者间循环,细胞内的竞争性的羰基还原酶因得不到足够的辅酶NAD(P)H而无法表现活性。此外,通过建立甲苯(20%v/v)-PBS缓冲液两相反应体系,避免了产物香茅醛的进一步降解,实现了产物的有效积累。

关键词：烯键还原酶 OYE2p 柠檬醛 (R)-香茅醛对映体选择性

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